Protective effects of hibiscus syriacus L. (Mugunghwa) on the skin against inflamm-aging = 염증성노화 피부에 대한 무궁화의 보호 효과에 대한 연구

국문 초록 (Abstract)

연구배경:“Inflamm-aging”이란 피부의 건강과 노화에 있어서 새로운 용어이다. Inflamm-aging은 염증성 노화라고도 알려져 있으며, 만성 염증과 지속적인 낮은 수준의 자극으로부터 유발되는 염증을 말한다. 이것은 노화의 진행을 증가시키고 궁극적으로는 피부 방어 시스템을 고갈시키는 다양한 피부 변화를 유발시킨다. 일반적으로 “무궁화” 라고 알려져 있는 Hibiscus syriacus (H. syriacus)는 한국의 국화이다. 비록 히비스커스 종의 피부 효능에 관한 많은 연구가 있지만, H. syriacus 에 대한 연구는 거의 없다. 게다가, H. syriacus의 생물학적 효능 성분을 다른 Hibiscus 종과 비교한 연구는 없었다.
연구목적: 이번 연구는 염증성 노화 피부에 대한 H. syriacus 의 보호 효과를 확인하기 위해 수행하였다. 또한, 이번 연구에서는 “Inflamm-aging” 에 대한 H. syriacus(목근피와 꽃)의 피부 보호 효과를 in vitro 와 인체적용시험을 통해 검증하는 것에 초점을 맞추었다.
연구방법: Part A에서는 H. syriacus 의 항노화 그리고 항염 활성을 in vitro 연구를 통해 성공적으로 확인하였다. 분자 생물학적 방법으로 ELISA 키트를 사용하여 MMP-1, MMP-3, IL-6, type I procollagen, IL-1ß 그리고 COX-2의 단백질 발현량을 확인하였다. MMP-1, type I procollagen, IL-6, IL-1ß 그리고 COX-2의 mRNA 발현량을 RT-PCR 방법을 사용하여 확인하였다. Western blot 분석법을 사용하여 pERK, pJNK 그리고 p38 의 단백질 발현량을 확인하여 MAPKs/AP-1 기전을 확인하였다. Part B에서는 세 가지 임상실험을 실시하여 H. syriacus 의 주름 방지, 피부 진정 및 모공 개선 효과를 확인하였다. 이것은 인체적용시험에서 각각 크림, 마스크팩, 앰플로서 피부에 적용되었다.
연구결과: Part A에서, H. syriacus cortexes (HC)가 광노화를 유의적으로 감소시키는 반면, H. syriacus flowers (HF)가 염증 손상으로부터 피부 세포를 가장 효과적으로 보호한다는 것을 보여주었다. 첫째, HC는 UVB 를 조사한 대조군과 비교하여 MMP-1 (54.4% 감소), MMP-3 (51.3% 감소), IL-6 (20.5% 감소), AP-1 (34.9 % 감소), p-c-Jun (14.8% 감소) 그리고 p-ERK (6.0% 감소)의 단백질 발현량을 나타내었다. 또한, HC 는 히알루로난 자극(358.7%)을 통해 피부 보습 활성을 촉진시켰다. 반면, HF는 NO 생성을 96.4% 감소 시켰다. 또한, LPS를 처리한 대조군에 비하여 단백질 발현량을 IL-6, IL-1β, COX-2, p-JNK, p-ERK, 그리고 p-p38 의 발현량을 각각 12.8%, 22.2%, 29.2%, 47.6%, 43.2% 그리고 80.4% 감소 시켰다. 또한, HF는 상처 부위를 38.9% 감소시키는 것을 확인하였다.
Part B에서, 세 가지 인체적용시험 중, 첫 번째 인체적용시험은 H. syriacus 추출물을 함유한 페이셜 크림을 12주간 사용하였을 때 대조군과 비교하여 22.9%의 주름 개선 효과를 발생시키는 것을 확인하였다. 두번째 인체적용시험에서는 H. syriacus 추출물이 함유된 마스크팩을 4주간 사용하였을 때 피부 수분을 8.01% 증가시켰다. 마지막으로, 세번째 인체적용시험은 H. syriacus 추출물이 함유된 앰플을 4주간 사용하였을 때 모공 크기를 7.88% 감소시키는 것을 확인하였다.
결론: 이번 연구에서, H. syriacus 는 한국의 국가 브랜드 정체성을 세계 무대에서 차별화하고 더욱 확고히 할 수 있도록 널리 사용되는 소재로서 발전 가능성을 보여주었다. 하지만, 향후 피부 장벽과 색소침착과 같은 염증성노화에 대한 추가 연구가 필요하다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: “Inflamm-aging” is a new word in skin health and aging. Inflamm-aging, also known as inflammaging, describes chronic and continuous low-grade inflammation. It causes a number of skin changes that increase the aging process and ultimately exhausts the skin’s defense system. Hibiscus syriacus L., commonly known as “Mugungwha” in Korean, is a Republic of Korea’s national flower. Although Hibiscus has various studies on the beneficial effects onto human skin, studies of H. syriacus have been rarely described.
Objectives: This study was conducted to confirm the protective effects of H. syriacus L. on skin against inflamm-aging. In this study, It was studied that the skin inflamm-aging effects of H. syriacus (cortexes and flowers), which were investigated using in vitro studies and clinical studies.

Methods: In the part A, the anti-aging and anti-inflammatory activities of Hibiscus syriacus extract were successfully detected in vitro studies. Molecular assays were performed including MMP-1, MMP-3, IL-6, type I procollagen, IL-1ß and COX-2 using ELISA kits. MMP-1, type I procollagen, IL-6, IL-1ß and COX-2 were analyzed by RT-PCR. Western blot analysis was performed to detect AP-1 and MAPKs, pERK, pJNK and p38 activation levels. In the part B, Three cases of clinical trials were conducted to confirm that anti-wrinkle, skin soothing and pore-improving effects of H. syriacus. Which is applied to human skin as cream, facial mask and an ampoule, respectively in clinical studies.
Results: In the part A, results showed that H. syriacus cortexes (HC) significantly reduced skin photoaging, while H. syriacus flowers (HF) most effectively protected skin cells against inflammatory damage. First, HC showed that the protein expression levels of MMP-1 (down to 54.4%), MMP-3 (down to 51.3%), IL-6 (down to 20.5%), AP-1 (down to 34.9 %), p-c-Jun (down to 14.8%) and p-ERK (down to 6.0%) respectively, compared with that in UVB irradiation control cells. In addition, HC enhanced skin hydrating activity by hyaluronan stimulation (358.7%). On the other hand, the NO production decreased by 96.4% with HF. And HF showed decreased protein expressions of IL-6, IL-1β, COX-2, p-JNK, p-ERK, and p-p38 by 12.8%, 22.2%, 29.2%, 47.6%, 43.2%, and 80.4% respectively, compared with that in LPS treated control cells. Also, HF possessed a 38.9% reduction of wound site.
In the Part B, among the three clinical trials, the first clinical test demonstrated that facial cream containing H. syriacus extract can generate 22.9% wrinkle-improvement effects to the subjects when used for 12 weeks compared to the control group. In the second clinical trials, facial mask sheet containing H. syriacus extract increased skin hydration of the subject by 8.01% when used for 4 weeks. Last, the third clinical trials showed that the pore volume size of the subject who applied ampoules containing H. syriacus extract for 4 weeks decreased by 7.88%
Conclusion: In this study, H. syriacus showed great potential for further development as a prominently effective material, representing Korea’s national brand identity on the global stage. However, further researches are needed for inflamm-aging on the skin barrier and pigmentation in the future.

목차 (Table of Contents)

• Part A
• Protective effects of H. syriacus L.
• on the skin against inflamm-aging : in vitro
• Ⅰ. Introduction……………...………..…………………………………..…..……….………1
• 1. Overview of skin inflammation and aging mechanisms……………………………………1
• 1.1. Skin inflammation…………………………………………………..…………………3
• 1.2. Skin aging………………………………………………………..……………….……5
• 1.3. Inflamm-aging in the skin………………………………………………………..……7
• 1.4. Biomarkers and signaling pathways of skin inflamm-aging…………………....……8
• 2. The Genus Hibiscus………………………………………………………………….…….14
• 2.1. Distribution of Hibiscus species……………………………………………….…….14
• 2.2. Hibiscus syriacus (Hibiscus species in KOREA) ………………………..…………17
• 2.3. Pharmacological effects of Hibiscus species………………………..………………19
• 2.4. Cortexes ………………………..………………………………………………....….22
• 2.5. Flowers…………………………………..………………………………………..….23
• 2.6. Leaves…………………………………..……….………………………………..…..24
• 2.7. Roots…………………………………..……….………………………………..……25
• 2.8. Seeds…………………………………..……….………………………………..……26
• 3. Study purpose…….. …………………………………..……….………………………….28
• Ⅱ. Materials and Methods……………...………..…………………………………..…..…32
• 1. Materials…………………………………………………..……….………………………32
• 2. Sample preparation…………………………………………………..……….……………34
• 3. Identification of major compounds…………………………………………………..……36
• 4. Cell culture and MTT assay……………………………………………………………….40
• 5. Sample treatment……………………………………………………………………….….40
• 5.1. UVB irradiation and sample treatment………………………………………………40
• 5.2. Inflammatory induction and sample treatment………………………………………41
• 6. Measurement of ROS production………………………………………………………….41
• 7. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ………………………………………….42
• 8. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) …………..………………..42
• 9. Western blot analysis………………………………………………….…………………..43
• 10. Wound scratch assay……………………………………………………………………..44
• 11. Statistical analysis………………………………………………………………………..44
• Ⅲ. Results……………...………..…………………………………..…..……….………….45
• 1. Comparison of quantitative analysis results of major compounds in H. syriacus….……45
• 1.1. Quantitative analysis of major compounds using gas chromatography (GC) ……..45
• 1.2. Quantitative analysis of major compounds using ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) ……………...………………………..…………………47
• 2. The effects of HC and HF on skin anti-oxidant: in-vitro ………………..………………49
• 3. The effects of HC on skin anti-photoaging: in-vitro………………...……………………51
• 3.1. Effects of HC on the skin anti-photoaging related protein expression level…..……51
• 3.2. Effects of HC on MMP-1 and procollagen type I mRNA expression…..………..…53
• 3.3. Effects of HC on MAPK and AP-1 protein expression…..………………………..…55
• 3.4. Effects of HC on hyaluronan production…..………………………..…….………...57
• 4. The effects of HF on skin anti-inflammatory: in-vitro………………………..……..…..59
• 4.1 Effects of HF on nitric oxide production…………………………………..……..…..59
• 4.2. Effects of HF on the pro-inflammatory cytokines expression level…………….…..61
• 4.3. Effects of HF the inflammation-related cytokines mRNA expression………………63
• 4.4. Effects of HF on MAPK protein expression…………………………………………65
• 4.5. Effects of HF on wound scratching test………………………………………………67
• Ⅳ. Discussion……………...………..…………………………………..…..……….……...69
• Ⅴ. References……………...………..…………………………………..…..……....……...78
• Part B
• Protective effects of H. syriacus L.
• on the skin against inflamm-aging : A Clinical Study
• Ⅰ. Introduction……………...………..…………………………………..…..……….……..82
• Ⅱ. Materials and Methods……………...………..…………………………………..…..…91
• 1. Trial design ...……………………………………………..……….………………………91
• 2. Study design and participants ..……………………………………..……….……………92
• 3. Preparation of H. syriacus extract cosmetics ……..……………………..……….…….100
• 4. Sample treatment……………………………………………………………………..…..103
• 5. Visual assessment ………………………………………………………………………..104
• 6. Skin measurements and analysis ………………………………………………………...104
• 7. Questionnaire study………………………………………………………………………108
• 8. Safety assessment………………………………………………………………………...109
• 9. Statistical analysis..………………………………………………………………..……..109
• Ⅲ. Results……………...………..…………………………………..…..……….………...111
• 1. Visual assessment ……………………………………..…………………………………111
• 2. Skin measurements and analysis ………………………………………………………...114
• 3. Questionnaire study ………………..…………………………..…………..………….…124
• 4. Safety assessment… ……………...……………………………………………………...126
• Ⅳ. Discussion……………...………..…………………………………..…..……….…….127
• Ⅴ. Conclusion……..……...………..…………………………………..…..……....…….131
• Ⅵ. References...………………...……..……………………...………..…..……....…….133
• Appendix Ⅰ……...………………...……..……………………...………..…..……....…….135
• 국 문 초 록...………..……………………....……………………...…..…..……....…….150