다이옥신에 의해 유발되는 면역장애에서 고밀도 유전자칩을 이용 한 유전자표식자의 발굴과 적용에 관한 연구 = Identification of the marker-genes for dioxin -induced immune dysfunction by using the high-density oligonucleotide microarray in mice blood, and its potential application

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In mammals, TCDD (2,3,7,8-tetradibenzo-p-dioxin) produce cancer, endocrine alteration, immunological change, and birth defects. The stem cell activity and the global expression profiles were studied in bone marrow cells of male C57BL/6N mice after an intraperitoneal injection (i.p.) of 0.1 or 1 ug TCDD/kg body weight at various time intervals: gestation 6.5 day, 13,5 day, 18.0 day, and postnatal 3 and 6 weeks. The animals were sacrificed at postnatal 10 week. The proliferation activities of bone marrow stem cell were more attenuated by the earlier exposure ranging 84%(p6W, 0.1 µg/kg) to 65%(G6.5D, 0.1 µg/kg), and decreased as a dose dependent manner by increasing the doses from 0.1 µg/kg (65%, G6.5D) to 1 µg/kg (45%, G6.5D) on colony forming assay (CFC). This suggests that the HSCs formed at the early stage of development are more important in the immune function of adult by continuous supply of immune progenitor cells. The expression patterns of the whole genes were analyzed by self-organizing maps(SOM). The gene expression profiles that represent the specific exposure of 1.0 ug/kg TCDD during the development could be idetifed as follows; G6.5D(C5), G13.5D(C22), G18.5D(C10, C11, C14), P3W(C7), P6W(C17). Considering the reproducibility of the mining of biomarkers, the microarray experiments were duplicated for the 1.0 ug/kg TCDD exposure groups, and the candidates were restricted for the genes expressed greater than + 2 -fold. Resulting candidates were 115 genes, the characteristics of that were involved in cell physiology and cell functions such as cell proliferation and immune function. Among the 115 genes, we selected the genes that could be found in the stage - specific SOMs, such as two genes(SOM C22: ferritin heavy chain gene, adenovirus e1b 19 kda-interacting protein 3-like gene) for G13.5D, one gene(C10: cdna clone eukary translat elongation factor 1 alpha 1 gene) for G18.5D, 18 genes(C7: ribosomal protein l6 genes, etc) for P3W. The above genes are proposed to be a potential use of biomarker for dioxin exposure in the case of immume dysfunctions.

국문 초록 (Abstract)

Dioxin 노출은 급성 독성장애 뿐 아니라 강력한 발암원이며 또한 내분비계, 신경계장애 및 태아의 기형 등 광봄위한 장애를 유발한다. Dioxin의 독성 평가에 관한 연구는 노출 정도를 반영하는 biomarker를 계측하여 오염정도를 평가해 왔다. 특히 Dioxin에 의한 면역장애는 개체가 면역기관이 성숙된 후에 나타나므로 dioxin의 노출에 의한 평가가 매우 어렵다. 또한 내분비장애물질의 노출결과로서 기능장애(면역장애)를 일으킨 경우, 그 특이 과정을 반영할 수 있는 biomarker를 개발하는 시도가 별로 이루어지지 않았다. 이에 생쥐에 dioxin을 폭로하여 면역장애를 일으킨 시스템에서 임신 중 혹은 성체가 된 후를 면역체계에 발생한 장애를 선별적으로 반영하거나, 투여량-기능변화를 정성, 정량적으로 반영할 수 있는 유전자를 탐색 하였다. 본 연구에서는 C57BL/6 생쥐에서 임신으로부터 발생 성장 중의 여러 단계(태령 6.5일 13.5일, 18일, 생후 3주 6주)에서 5마리를 한 군으로 하여 2,3,7,8-TCDD를 0.1 및 1.0 microgram/kg 무게로 복강 내 주사 1회 처리하여 생후 10주에 동물을 희생하여, 잠재된 면역세포기능의 변화를 확인하기 위해 골수세포의 colony forming 활성도를 측정한 결과, 0.1 ug/kg 용량으로 태생 전에 주사한 군(35% 감소)이 생후에 주사한 군(16% 감소)에서 보다 콜로니 형성이 현저하게 줄어들었고, 1.0 ug/kg 용량으로 처리한 군에서는 감소의 정도가 더욱 커서 55% 및 35%까지 감소하였다. 혈액에서의 유전자 발현의 변화를 위해 각 군에 대해 생쥐용 고밀도(11K) oligonucleotide microarray에서 유전자의 발현 양상을 조사하였다. 전체 유전자에 대해 Self-organization maps(SOM) clustering을 시행하여 각시기별로 특이한 유전자 벌현의 변동을 관찰 할 수 있었다. TCDD 고용량(1.0ug/kg)으로 처리한 군에 대해 시기별 노출을 대변할 수 있는 SOM은 G6.5D(C5), G13.5D(C22), G18.5D(C10, C11, C14), P3W(C7), P6W(C17) 이었다. Biomarker 개발에 있어 재현성을 확보하기 위해 1.0ug/kg TCDD로 노출된 군에 대해 microarray 실험을 중복하여 시행하였고, 각 군에서 유전자 발현이 2배 이상으로 증가 혹은 감소한 유전자로 국한하고 또한 두 번의 microarray에서 실험에서 재현되는 유전자들을 선별한 결과 총 115개의 유전자를 선정할 수 있었다. 이 유전자의 특성을 gene ontology로 변화를 알아보았으며, 특히 세포의 증식에 관여하는 유전자 군 및 면역기능에 관여하는 유전자 들 중에서 변화가 많았다. 마지막으로 TCDD의 시기별 노출에 특이적으로 발현이 크게 변화하여 대표할 수 있는 유전자를 발굴하기 위해 시기별 대변이 가능한 SOM과, 재현성이 있는 유전자 115개 중에서 그 결과가 서로 일치하는 유전자는 G13.5D에서 SOM C22인 유전자 2개ferritin heavy chain gene, adenovirus e1b 19 kda-interacting protein 3-like gene), G18.5D에서 C10에 해당하는 유전자 1개(cdna clone eukary translat elongation factor 1 alpha 1gene), P3W에서 C7 유전자 18개(C7: ribosomal protein l6 genes 와 17개) 를 발굴할 수 있었다. 이상 열거한 유전자들이 dioxin 폭로로 인한 시기별 면역 장애를 반영할 가능성이 있다고 생각되며, 다른 transcript 수준에서 검정을 시행하여 dioxin에 의한 면역 장애 및 노출 영향을 평가하는 biomarker로서의 시용 가능성에 대해 제안한다.
○ 연구목표 : 식품이나 환경 등에서 내분비 장애물질(예 dioxin)을 측정하거나, 그 노출 정도를 반영하는 biomarker를 계측하여 오염정도를 평가해 왔으나, 내분비장애물질의 노출결과로서 기능장애(면역장애)를 일으킨경우, 그 특이 과정을 반영할 수 있는 biomarker를 개발하는 시도가 별로 이루어지지 않았음. 이에 생쥐에 dioxin을 폭로하여 면역장애를 일으킨 시스템에서 이를 반영하는 유전자 biomarker를 개발고자함. 이는 최근 생쥐게놈지도가 발표되고 고밀도 유전자 칩이 상용화되어 가능하게 됨. 이 연구를 통해 dioxin에 의한 급성독성 상태(질환)뿐 아니라 면역장애를 일으킨다고 추정되는 면역질환(아토피, 피부염 발암기전에 이르기까지)에 손쉽게 적용할 수 있는 유전자칩(biochip)을 개발하고 적용가능성을 제안함에 있음.
○ 연구내용 : 면역장애를 일으키는 농도의 2,3,7,8-TCDD를 C57BL/6 생쥐에 처리한 후, 혈액에서 발현이 변화되는 유전자를 고밀도 oligonucleotide microarray를 이용하여 검색하며, 이중 임신 중 혹은 성체가 된 후를 면역체계에 발생한 장애를 선별적으로 반영하거나, 투여량-기능변화를 정성, 정량적으로 반영할 수 있는 유전자를 발굴한다. 즉 임신으로부터 발생 성장 중의 여러 단계(태령 6.5일 13.5일, 18일, 생후 3주 6주)에서 5마리를 한 군으로 하여 2,3,7,8-TCDD를 0.1 및 1.0 microgram/kg 무게로 복강 내 주사 1회 처리하여 생후10주에 동물을 희생한다. 흉선, 비장은 무게를 재고, 골수 및 혈액의 세포를 포함하여 태아시절로부터 잠재된 면역세포기능의 변화를 확인하기 위해 골수세포의 colony forming 활성도를 측정한다. 혈액에서 유전자 발현의 변화를 위해 각 군에서 3개의 시료를 택하여 생쥐용 고밀도(11K) oligonucleotide microarray 에 증폭하여 cy3와 cy5로 표식한 cRNA 로 hybridizatio하여 형관의상대적 양을 Imagene v4.1 software를 사용하여 수치화하여 통계학적으로 분석함. 이로서 변화된 유전자로서 태아기로부터 성체에 이르기까지 각 성장시기에 따른 dioxin에 노출을 반영할 수 있는 유전자를 발굴함
○ 연구성과(응용분야 및 활용범위포함) : Self-organization maps(SOM) clustering을 시행하여 각 시기별로 특이한 유전자 벌현의 변동을 보이며, 두 번의 microarray에서 실험에서 재현되며, 발현변화의 폭이 2배이상으로 큰 유전자 중에서 G13.5D에 서 SOM C22인 유전자 2개ferritin heavy chain gene, adenovirus e1b 19 kda-interacting protein 3-like gene), G18.5D에서 C10에 해당하는 유전자 1개(cdna clone eukary translat elongation factor 1 alpha 1 gene), P3W에서 C7 유전자 18개(C7: ribosomal protein l6 genes 와 17개) 가 dioxin 폭로로 인한 시기별면역 장애를 반영할 가능성이 있다고 생각되며, dioxin에 의한 면역 장애 및 노출 영향을 평가하는 biomarker로서의 시용 가능성에 대해 제안한다. 이같은 결과는 산업화의 결과 천식 등의 면역질환이 급격히 증가하는데, 알레르겐의 증가뿐 아니라 dioxin의 영향이 대두되고 있어, 내분비 교란물질인 dioxin이 면역 시스템에 미치는 교란의 영향으로 발생하는 면역 질환들에 대해 기전을 이해하는데 사용될 수 있다. 산업적 응용측면으로는 기타 dioxin에 반응하는 (발현양이 변하는) 유전자 군을 이용하여 dioxin 노출 진단 용 DNA chip개발하여 진단에 걸리는 시간과 비용을 절약하는데 이용이 가능하다고 생각한다.