The anti-atherosclerotic effect of anakinra, a recombinant human interleukin-1 receptor antagonist, in apolipoprotein E-knockout mice = 아포지단백 E-결핍 마우스에서 재조합 인간 인터루킨-1 수용체 길항제 아나킨라(anakinra)의 항동맥경화 효과

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Introduction
Accumulated evidence suggest that interleukin (IL)-1β plays a substantial role in the pathogenesis of atherosclerosis. The aim of this study was to evaluate the effect of anakinra, a recombinant human IL-1 receptor antagonist, on the progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-knockout (ApoE–/–) mice.

Materials and Methods
Forty 8-week-old male ApoE–/– mice were fed a standard chow diet for 4 weeks followed by a atherogenic diet (35 kcal% fat, 1.25% cholesterol, and 0.5% sodium cholic acid) for 12 weeks and divided into 4 groups: control (saline), anakinra 10 mg/kg, 25 mg/kg, and 50 mg/kg (n = 10 in each group). En face analyses of aortic arches were compared for size of atheromatous plaques in each group. In vitro study, inflammatory genes and signaling pathways were evaluated in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), rat aortic smooth muscle cells (RAOSMCs), and 3T3-L1 adipocytes.

Results
In light of atherosclerosis, chronic treatment of anakinra significantly reduced the plaque sizes in the aortic arch by 30.6% and 25.2% at the 25 mg/kg and 50 mg/kg doses (both P <0.05, compared with vehicle treated group) and decreased serum triglyceride level compared to control group in ApoE–/– mice. In HUVECs and RAOSMCs, anakinra suppressed mRNA expressions of IL-1β and IL-6 compared to control group (all P <0.05). Anakinra significantly reduced metalloproteinase-9 mRNA expression in RAOSMCs. In addition, anakinra inhibited cellular migration capability measured by the wound-healing assay in RAOSMCs (57% reduction compared to the control group, P <0.001). Anakinra effected on the phosphorylation of NF-κB p65 and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, respectively (P <0.05). In terms of fat metabolism, anakinra group exhibited a tendency of lower CD 68+ macrophage infiltration in visceral adipose tissue. In 3T3-L1 adipocytes, anakinra reduced the mRNA expressions of NLRP3 inflammasome and monocyte chemoattractant protein-1 compared with control group (all P <0.05).

Conclusion
IL-1 blockade with anakinra significantly reduced atherosclerotic plaque formation in ApoE–/– mice. Additionally, inflammatory genes and vascular remodeling were ameliorated by anakinra in endothelial cells, smooth muscle cells, and adipocytes. Taken together, anakinra could be a part of complementary treatment strategies to reduce the remained residual cardiovascular risk despite on standard regimens.

국문 초록 (Abstract)

서론: 만성적인 염증이 죽상동맥경화증의 발생 및 진행에 미치는 영향은 널리 알려져 있다. 현재까지 죽상동맥경화증의 예방과 치료에는 주로 스타틴, 에제티미브, 프로-단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형 (pro-protein convertase subtilisin/kexin type 9) 저해제 계열의 지질강하제가 주로 사용이 되어 왔다. 죽상동맥경화증의 주요 기전인 만성 염증을 효과적으로 억제하는 것이 지질강하제만으로는 극복하지 못하는 한계를 극복해 나갈 수 있을 것이다. 특히, 최근에는 죽상동맥경화증 발생 및 진행에 인터루킨(Interleukin, IL)-1β가 중요한 역할을 한다는 연구 결과들이 축적되고 있는데, 이는 대식세포에서 분비하는 대표적인 전염증성 사이토카인으로서 열, 사이토카인 합성 증가, 백혈구의 응집, 섬유아세포의 활성화 및 내막세포 유전자를 조절하는 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이 연구의 목적은 죽상동맥경화증 동물 모델인 아포지단백 E-결핍 (ApoE-/-) 마우스에서 재조합 인간 IL-1 수용체 길항제인 아나킨라(anakinra)이 죽상동맥경화증의 진행에 미치는 영향 및 그 기전을 규명하고, 향후 임상적인 유용성을 평가하고자 하는 것이다.

연구방법: 8주령 수컷 ApoE-/- 마우스 40마리에 4주간 일반식이(standard chow diet)를 섭취시키고, 이후 12주간 동맥경화유발 식이(atherogenic diet; 35 kcal% 지방, 1.25% 콜레스테롤, and 0.5% 담즙산)를 섭취하여 죽상동맥경화증 동물 모델을 확립하였다. 대조군(생리식염수), 아나킨라 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50mg/kg 군으로 각 군당 10마리씩 배정하였다. En face 분석을 통해 대동맥궁의 동맥경화반의 크기를 비교하였다.
아나킨라의 동맥경화증 발생 및 진행에 관여하는 기전을 확인하기 위해, 인간제대정맥내피세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC), 쥐의 대동맥평활근세포(rat aortic smooth muscle cell, RAOSMC), 3T3-L1 지방세포에 리포폴리사카라이드 (Lipopolysaccharide, LPS)와 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)-α를 처리하여 염증유발모델을 구축하였다. 이 세포주에 다양한 농도의 아나킨라를 처리한 후 IL-1β, NLRP3 인플라마좀의 발현, 염증성 유전자 mRNA 발현 정도를 측정하였다. 또한, 아나킨라의 세포내 신호 전달을 매개하는 기전을 확인하기 위해 웨스턴 블롯(western blot)으로 핵인자 κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB) 및 미토겐 활성화단백질 키나아제 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 경로 단백질 발현을 확인하였다. 하위 한편, 죽상동맥경화 진행에 주요한 역할을 하는 세포 이동에 대한 아나킨라의 역할을 확인하기 위해 RAOSMC에서 상처 치유 분석 (wound healing assay)를 시행하였다.

결과: 아나킨라의 장기 투약은 ApoE-/- 마우스의 대동맥궁에서 동맥경화반의 유의한 감소를 보여주었고, 혈청 중성지방의 감소 역시 뚜렷하였다. 아나킨라 투약 ApoE-/-군의 내장지방 내 CD68양성 대식세포의 발현이 대조군에 비해 감소되는 경향을 확인하였다.
HUVEC에서 아나킨라 투약군에서 IL-1β와 염증성 사이토카인인 IL-6 감소가 뚜렷하게 관찰되었다. RAOSMC에서 아나킨라 투약군에서 NLRP3 인플라마좀, IL-1β, IL-6 감소 및 기질금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase-9) 발현 또한 유의한 감소를 보였다. 3T3-L1 지방세포에서 아나킨라 투여 후 NLRP3 인플라마좀과 단핵세포화학유인물질단백질-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)의 유의한 감소를 확인하였다.
아나킨라로 처리한 RAOSMC에서, LPS와 TNF-α로 유발된 p38 과 p65 의 인산화가 강력히 억제됨에 따라, 아나킨라가 NF-κB의 핵 전위 감소와 MAPK 억제를 통해 항염증반응을 보인다는 것을 확인하였다.
상처 치유 분석을 통해 아나킨라는 죽상동맥경화증 진행에 중요한 역할을 하는 세포 이동 (cell migration)에 대해 유의한 억제 효과를 보여주었다.

결론: 아나킨라를 통한 IL-1 차단은 ApoE-/- 마우스에서 죽상동맥경화반의 형성을 유의하게 감소시켰다. 또한 HUVEC, RAOSMC, 3T3-L1 세포에서 염증성 유전자의 발현을 억제하였으며, RAOSMC의 세포 이동을 억제하여 혈관 재형성에 영향을 주었다. 결론적으로 아나킨라는 기존 표준 치료의 한계인 잔존 심혈관질환의 위험성에 대해 기전적 치료 기반 전략으로서의 가능성을 보여주었다.

목차 (Table of Contents)

• Introduction 1
• Materials and Methods 6
• 1. Animals, diet, and treatment protocols 6
• 2. Immunofluorescence stain for CD68 8
• 3. THP-1 conditioned media and induction of NLRP3 inflammasome in HUVECs, RAOSMCs, and 3T3-L1 cells 8
• 4. Quantitative real-time PCR 9
• 5. Western Blot Analysis 12
• 6. RAOSMCs migration assays 13
• 7. Statistical analysis 13
• Results Focus on atherosclerosis 14
• 1. Anakinra reduces the atherosclerotic plaque area in ApoE/ mice 14
• 2. The dose-dependent effect of anakinra on the activation of the NLRP3 inflammasome and upregulated expression of inflammatory adhesion molecules in HUVECs 17
• 3. The dose-dependent effect of anakinra on the activation of the NLRP3 inflammasome and upregulated expression of angiogenesis molecules in RAOSMCs 20
• 4. The effect of anakinra on the p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)/nuclear factor-κB (NF-κB) pathway in RAOSMCs and HUVECs 23
• 5. Anakinra inhibits cell migration of RAOSMCs 26
• Focus on fat 28
• 6. Immunofluorescence staining of CD68 in visceral adipose tissue 28
• 7. The dose-dependent effect of anakinra on the activated NLRP3 inflammasome and upregulated expression of inflammatory molecules in 3T3-L1 adipocytes. 30
• 8. Expression of phosphorylated c-Jun N-terminal kinase (p-JNK), p-p38 and p-ERK in the liver and visceral adipose tissue. 32
• Discussion 35
• References 42
• 국문초록 53
• Acknowledgements 57