로타바이러스 항체 기준시약 개발 연구 = Development of National Standard Reagents for Rotaviruses

국문 초록 (Abstract)

로타바이러스는 어린 아이에 있어서 장염의 원인체 중 가장 중요한 바이러스로 후진국이나 개발 도상국 뿐만 아니라 선진국에서도 심한 설사를 일으키는 중요한 원인체로 알려져 있다. 이러한 이유로 로타바이러스에 대한 예방약 개발이 오래 전부터 WHO를 비롯하여 여러 나라에서 시도되고 있다. 국내 혹은 외국에서 개발된 로타바이러스 백신의 임상적인 효능성을 확인하기 위해서는 각 지역에 분포하는 로타바이러스의 검색 및 혈청형이 확인되어야 하며, 이를 위해 각각의 혈청형을 정확하게 검색, 확인할 수 있는 표준항체 또는 핵산 시약의 확보가 필수적이다. 또한 혈청형에 특이적으로 반응하는 표준항체 또는 핵산시약은 로타바이러스 관련 제품을 평가하는데 필수적으로 필요한 것이다. 본 연구에서는 로타바이러스 감염실태 및 로타바이러스 혈청형 분포에 대한 역학조사, 그리고 로타바이러스와 관련된 제품의 평가를 위해 로타바이러스에 특이적인 표준항체를 단크론항체와 복합항체 형태로 개발하는데 있다. 단크론항체와 복합항체를 이용하여 이미 확립한 간접 sandwich 효소면역법의 validation 검사를 위하여 일련의 야외 분변재료를 이용하여 민감도와 특이성을 조사한 결과, 각각 92.6%와 91.9%로 나타나 분변으로부터 직접 로타바이러스를 검출하는데 유용하게 사용될 것으로 생각된다. 분변으로부터 직접 로타바이러스 혈청형 (G3, G4)을 확인할 수 있는 효소면역법 확립 시험에서 시험에 사용된 각각의 혈청형에 특이적인 단크론항체는 높은 수준의 중화항체역가를 가지고 있음에도 불구하고 효소면역법에서는 반응성이 낮아 G3, G4의 감별이 불가능하였다. 하지만 과 아군(subgroup I, II)을 감별할 수 있는 효소면역법에서는 직접 분변을 이용하여 정확하게 subgroup I, II의 감별이 가능하여 로타바이러스 역학 연구에 유용하게 활용될 것으로 생각된다. 4개의 표준주 로타바이러스 (Wa/G1P[8], DS-1/G2P[4], M/G3P[6], ST-3/G4P[6])를 사용하여 로타바이러스 VP4에 특이적으로 반응하는 단크론항체를 생산하였으며 또한 각각의 VP4 단백에 특이적인 복합항체 생산 및 면역반응 조사에 필요한 항원을 생산하기 위하여 Wa, DS-1 그리고 ST-3 표준주로부터 VP4 유전자를 크로닝하여 진핵세포 발현체계인 배큘로바이러스에서 발현시키고 발현된 VP4 단백을 확인하고 이들의 특성을 규명하였다. 재조합바이러스에서 VP4 유전자는 PCR법으로 확인하였으며 발현된 VP4 단백은 IFA법 및 Western blotting법으로 확인하였다. 배큘로바이러스에서 발현된 VP4 단백을 대량 생산하여 정제하고 이를 실험동물에 접종하여 VP4에 특이적인 복합항체를 생산하였다.○ 연구목표 : 로타바이러스는 어린 아이에 있어서 장염의 원인체 중 가장 중요한 바이러스로 후진국이나 개발 도상국 뿐만 아니라 선진국에서도 심한 설사를 일으키는 중요한 원인체로 알려져 있다. 전 세계적으로 로타바이러스 감염으로 인하여 매년 100만여 명의 어린 아이들이 사망한다고 보고 되어 있다. 이러한 이유로 로타바이러스에 대한 예방약 개발이 오래전부터 WHO를 비롯하여 여러 나라에서 시도되고 있다. 국내 혹은 외국에서 개발된 로타바이러스 백신의 임상적인 효능성을 확인하기 위해서는 국내에서 분포하는 로타바이러스의 혈청형이 확인되어야 하지만 현재까지는 국내에서 로타바이러스 혈청형의 종류와 분포에 관한 역학조사가 극히 일부분만이 국한적으로 조사되어 있다. 로타바이러스 혈청형의 종류와 분포에 관한 역학조사를 수행하기 위해서 각각의 혈청형을 정확하게 확인할 수 있는 표준항체의 개발이 필수적으로 필요하다. 또한 혈청형에 특이적으로 반응하는 표준항체는 로타바이러스 관련 제품을 평가하는데 필수적으로 필요한 것이다. 본 연구의 최종 목적은 로타바이러스 감염 및 혈청형 또는 유전형 분포에 대한 역학조사 및 제품평가를 위해 각종 혈청형에 특이적인 표준항체를 개발하고 이를 이용한 표준화된 시험방법을 확립하는 것이다.
○ 연구내용 : 로타바이러스 감염실태, 혈청형의 종류와 분포에 관한 역학조사는 로타바이러스 백신의 효능성을 확인하는데 필수적으로 선행되어야 할 연구로 로타바이러스 검출 및 각각의 혈청형을 정확하게 확인할 수 있는 표준항체의 개발이 필수적으로 필요하다. 또한 로타바이러스에 특이적으로 반응하는 표준항체는 로타바이러스 관련 제품을 평가하는데 필수적으로 필요한 것이다. 본 연구에서는 로타바이러스 검출 시험법의 validation 검사를 위하여 일련의 분변재료를 이용하여 특이성 및 민감도를 조사하였으며, 단크론항체와 복합항체를 사용하여 분변으로부터 직접 로타바이러스 혈청형 (G3, G4) 및 subgroup를 결정할 수 있는 면역효소법을 확립하기 위한 실험을 수행하였다. 또한, 4개의 표준주 로타바이러스 (Wa/G1P[8], DS-1/G2P[4], M/G3P[6], ST-3/G4P[6])를 사용하여 2차 년도에 확 립한 단크론항체 생산기법에 따라 로타바이러스 VP4에 특이적으로 반응하는 단크론항체를 생산하고 특성을 규명하였다. VP4에 대한 복합항체 생산과 면역반응 조사에 사용할 VP4를 준비하기 위하여 표준주 로타바이러스 Wa, DS-1 그리고 ST3의 VP4 유전자를 baculovirus에서 발현시키고 발현된 VP4 단백의 특성 을 규명하였다.
○ 연구성과(응용분야 및 활용범위포함) : 이미 확립한 간접 sandwich 효소면역법의 validation 검사를 위하여 일련의 야외 분변재료를 이용하여 민 감도와 특이성을 조사한 결과, 각각 92.6%와 91.9%로 나타나 분변으로부터 직접 로타바이러스를 검출하는데 유용하게 사용될 것으로 생각된다. 분변으로부터 직접 로타바이러스 혈청형 (G3, G4)을 확인할 수 있는 효소면역법 확립 시험에서 시험에 사용된 각각의 혈청형에 특이적인 단크론항체는 높은 수준의 중화항체역가를 가지고 있음에도 불구하고 효소면역법에서는 반응성이 낮아 G3, G4의 감별이 불가능하였다. 하지만 아군 (subgroup I, II)을 감별할 수 있는 효소면역법에서는 직접 분변을 이용하여 정확하게 subgroup I, II의 감별 이 가능하여 로타바이러스 역학 연구에 유용하게 활용될 것으로 생각된다. 4개의 표준주 로타바이러스 (Wa/G1P[8], DS-1/G2P[4], M/G3P[6], ST-3/G4P[6])를 사용하여 로타바이러스 VP4에 특이적으로 반응하는 단크론항체를 생산하였으며 또한 각각의 VP4 단백에 특이적인 복합항체 생산 및 면역반응 조사에 필요한 항원을 생산하기 위하여 Wa, DS-1 그리고 ST-3 표준주로부터 VP4 유전자를 크로닝하여 진핵세포 발현체계 인 배큘로바이러스에서 발현시키고 발현된 VP4 단백을 확인하고 이들의 특성을 규명하였다. 재조합바이러스에서 VP4 유전자는 PCR법으로 확인하였으며 발현된 VP4 단백은 IFA법 및 Western blotting법으로 확인 하였다. 배큘로바이러스에서 발현된 VP4 단백을 대량 생산하여 정제하고 이를 실험동물에 접종하여 VP4에 특이적인 복합항체를 생산하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Rotaviruses are known to be one of the most important virus to cause gastroenteritis and severe diarrhea in young children in underdeveloped and developing countries as well as developed countries. For this reason, several countries including WHO have tried to develope rotavirus vaccines during last two decades. To confirm the efficacy of rotavirus vaccines developed in home and foreign countries, first of all, detection of rotavirus and prevalence of rotavirus serotypes in problemed area should be performed and it is essential to have serotype-specific standard anti-rotavirus sera or nucleic acid reagents. Serotype-specific standard anti-rotavirus sera or nucleic acid reagents are also essentially necessary to evaluate the rotavirus related products. The objective of this study is to make rotavirus-specific standard mono- and polyclonal antibodies to be used for epidemiological studies such as prevalence of rotaviral infection and serotypes and for an evaluation of rotavirus related products. From the results of validation test of previously developed i-ELISA for direct detection of rotaviruses from fecal samples, the sensitivity and specificity were 92.6% and 91.9%, respectively. In experiment to develop rotavirus serotyping (G3 and G4) methods from fecal samples, monoclonal antibodies (MAbs) used did not differentiate G3 from G4 in ELISA system in spite of their high neutralizing antibody titers. However, the developed ELISA system using MAbs could differentiate subgroup I from II with accuracy and would be used effectively for epidemiological studies of rotaviral infection. Several rotavirus VP4-specific MAbs were produced and characterized using 4 human rotavirus reference strains (Wa/G1P[8], DS-1/G2P[4], M/G3P[6], ST-3/G4P[6]). For VP4 antigen preparation to be used for making VP4-specific polyclonal antibodies and for studying immune responses against rotavirus infection, VP4 gene from Wa, DS-1 and ST3 rotavirus strain was cloned and expressed in baculovirus expression system and its properties were characterized. The VP4 gene in recombinant viruses was confirmed by PCR and expressed VP4 in baculovirus was confirm by IFA and Western blotting. The VP4-specific polyclonal antibodies were produced using expressed VP4 and characterized.