방광암 바이오마커 NMP22 및 UBC（CK8）의 항체 기반 Native 항원 분리 정제를 이용한 콤보 진단 키트의 개발 및 분석적 성능 평가 = Development and Analytical Performance Evaluation of a Combo Diagnostic Kit for Bladder Cancer Biomarkers NMP22 and UBC （CK8） Using Native Antigens Isolated and Purified by Antibody-Based Affinity Column

국문 초록 (Abstract)

방광암은 재발률이 높고 장기간의 추적관찰이 필요한 대표적인 비뇨기계 악성종양으로, 조기 진단과 지속적인 모니터링이 중요하다. 현재 사용되는 방광경 검사는 진단 정확도가 높지만 침습적이며, 소변 세포검사는 저등급 방광암에서 민감도가 낮은 한계가 있다. 이에 따라 비침습적인 소변 기반 바이오마커를 이용한 면역진단 기술에 대한 관심이 증가하고 있다.
NMP22는 방광암 진단에 널리 활용되는 바이오마커이나 특이도에 한계가 있으며, UBC（CK8）는 종양세포 유래 cytokeratin 단편을 검출하는 바이오마커로 알려져 있다. 두 바이오마커를 동시에 활용할 경우 단일 마커 기반 진단의 한계를 보완할 가능성이 있다.
또한 기존 진단키트 개발에는 재조합 항원이 주로 사용되어 왔으나, 실제 생체 내 단백질의 구조와 차이가 있을 수 있어 native 항원의 활용 필요성이 제기되고 있다.
본 연구에서는 방광암 바이오마커인 NMP22 및 UBC（CK8）를 대상으로 항체 기반 affinity chromatography를 이용하여 방광암 세포 유래 native 항원을 분리·정제하고, 이를 이용한 콤보 면역진단키트를 개발하였다. 먼저 ELISA를 이용하여 각 바이오마커에 대한 반응성이 우수한 단일클론 항체를 선발하였다. 이후 후보 항체 간 pair test를 수행하여 면역크로마토그래피 진단키트에 적용하기 위한 최적의 항체 조합을 선정하였으며, native 항원 정제에 적합한 단일클론 항체를 cellulose resin에 결합하여 NMP22 및 UBC（CK8） 각각에 대한 affinity column을 구축하였다. 구축된 affinity column을 이용하여 방광암 세포 유래 시료로부터 native 항원을 분리·정제하였으며, 정제된 항원의 특성을 분석하였다. 이후 확보된 항원을 이용하여 두 바이오마커를 동시에 검출할 수 있는 콤보 면역진단키트를 설계 및 제작하였다.
개발된 콤보 진단키트의 분석적 성능은 spiked urine을 이용하여 검증하였다. 검출한계（Limit of Detection）, 재현성（Reproducibility）, 안정성（Stability）, 교차반응성（Cross-reactivity） 및 간섭시험（Interference）을 수행하여 기초 분석적 성능을 평가하였다.
또한 판정기준치 설정과 음성 및 양성 판독 특성을 확인하여 개발된 진단 시스템의 적용 가능성을 검토하였다. 다만 본 연구는 실제 환자 검체를 이용한 임상적 성능평가는 포함하지 않았으며, 분석적 성능 검증을 중심으로 수행되었다.
본 연구는 항체 기반 affinity chromatography를 이용하여 방광암 세포 유래 native NMP22 및 UBC（CK8） 항원을 확보하고 이를 활용한 콤보 면역진단키트 개발 가능성을 제시하였다는 점에서 의의가 있다. 또한 다중 바이오마커 기반 진단 플랫폼 구축과 분석적 성능 검증을 통해 향후 임상적 성능평가 및 소변 기반 방광암 보조진단기술 개발을 위한 기초자료를 제공할 것으로 기대된다. 다만 임상적 유용성에 대한 평가는 실제 환자 검체를 이용한 후속 연구를 통해 추가적으로 검증될 필요가 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urinary tract and is characterized by a high recurrence rate, requiring continuous monitoring and repeated diagnostic testing. Although cystoscopy is considered the gold standard for the diagnosis and surveillance of bladder cancer, the procedure is invasive and associated with patient discomfort and high medical costs. Therefore, there has been increasing interest in the development of non-invasive urinary biomarker-based diagnostic methods.
In this study, a combo diagnostic kit capable of simultaneously detecting the bladder cancer biomarkers NMP22 and UBC （CK8） was developed, and its analytical performance was evaluated. For the isolation and purification of native antigens, bladder cancer cells were cultured and cell extracts were prepared. Monoclonal antibodies showing high reactivity against NMP22 and UBC （CK8） were selected through ELISA-based analysis. The selected antibodies were conjugated to cellulose resin to prepare antibody-resin complexes, and affinity columns specific for each biomarker were constructed. Using these affinity columns, highly purified native antigens were isolated and purified. The purified native antigens were subsequently applied to the development of the combo diagnostic kit.
The developed kit was designed in a lateral flow immunoassay format for the simultaneous detection of NMP22 and UBC （CK8） in urine samples. Analytical performance evaluation was conducted according to guidelines for in vitro diagnostic medical devices, including limit of detection, reproducibility, stability, cross-reactivity, and interference tests. In addition, spiked urine samples containing purified native antigens were used to evaluate the practical applicability of the developed kit.
The results demonstrated that the developed combo diagnostic kit successfully detected both NMP22 and UBC （CK8） simultaneously without significant cross-reactivity or interference. Stable and reproducible detection performance was confirmed, and positive reactions were observed even at low concentrations in spiked urine samples.
These findings suggest that the developed combo diagnostic kit may serve as a useful non-invasive diagnostic tool for the simultaneous detection of bladder cancer biomarkers. Furthermore, the use of highly purified native antigens isolated through antibody-based affinity purification may contribute to improving the analytical performance and practical applicability of bladder cancer diagnostic assays.

목차 (Table of Contents)

• 제1장 서 론 1
• 제1절 연구의 목적 1
• 제2절 연구의 배경 4
• 제2장 연구에 관한 이론적 배경 6
• 제1절 방광암의 발생동향 및 특성 6
• 제2절 방광암의 특성과 진단 방법 8
• 제3절 소변 기반 바이오마커 9
• 1. NMP22 10
• 2. UBC （CK8/CK18） 11
• 제4절 면역진단 키트의 원리 13
• 제5절 항원단백질 정제 방법 및 Native 항원의 특성 15
• 제3장 연구의 범위 및 방법 16
• 제1절 연구의 범위 16
• 제2절 연구의 방법 17
• 1. 방광암 세포의 배양 및 세포 추출물 분리 17
• 2. 항체 단백질을 이용한 cellulose resin의 제조 20
• 3. Native 항원의 분리정제 21
• 4. 콤보 진단 키트의 설계 및 제작 22
• 5. 분석적 성능 평가 24
• 5.1 검출한계 （Limit of Detection, LOD） 24
• 5.2 재현성 （Reproducibility） 27
• 5.3 안정성 （Stability） 28
• 5.4 교차반응성 （Cross-Reactivity） 31
• 5.5 간섭반응성 （Interference） 32
• 5.6 모의 검체 （Spiked Urine）를 이용한 평가 33
• 제4장 연구 결과 35
• 제1절 Native 항원의 정제 결과 35
• 1. 정제수율 35
• 2. SDS-PAGE 분석 결과 39
• 3. 정제 항원에 대한 반응성 확인 43
• 제2절 분석적 성능 평가 결과 46
• 1. 검출한계 （LOD） 46
• 2. 재현성 50
• 3. 안정성 52
• 4. 교차반응성 53
• 5. 간섭시험 55
• 6. 모의 검체 적용 결과 57
• 제5장 고찰 61
• 제1절 Native 항원 활용의 의의 61
• 제2절 콤보 진단 키트 적용의 장점 62
• 제3절 분석적 성능 평가 결과에 대한 해석 64
• 제4절 연구의 한계 66
• 제5절 향후 연구 방향 67
• 참 고 문 헌 68
• ABSTRACT 73