Somatic mutations and their role in the pathogenesis of crohn’s disease

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Crohn’s disease is a chronic inflammatory bowel disease (IBD) characterized by discontinuous inflammation throughout the gastrointestinal tract. Cytokines are known to play a crucial role in inflammatory activation, and biological agents targeting TNF are commonly used as treatment. While other cytokine-targeting drugs have been developed, their effectiveness in Crohn’s disease remains uncertain, likely because of the heterogeneity of the disease.
IBD is an intractable disease of unknown etiology, with various factors contributing to its pathogenesis. Genetic predisposition has been implicated through twin studies, but germline mutations alone cannot fully explain the localized inflammation and sporadic nature of Crohn’s disease.
This study focuses on the relationship between somatic mutations and Crohn’s disease. Recent research has identified mutations in IL-17A pathway genes in intestinal epithelial organoids from IBD patients. Building on these findings, we analyze somatic mutations in intestinal epithelial cells induced by pro-inflammatory cytokines (IFN-γ, TNF-α) secreted by Th1 cells, in addition to the previously reported IL-17 pathway. Furthermore, we aim to elucidate the contribution of these mutations to Crohn’s disease progression and evaluate their potential as biomarkers for personalized treatment.
Tissue samples from 49 inflammatory sites, 58 non-inflammatory sites, and 9 remission sites were collected from Crohn’s disease patients and subjected to whole exome sequencing. A specialized mutation detection pipeline was developed and used to identify somatic mutations. The analysis revealed a significant accumulation of somatic mutations in epithelial cells under inflammatory conditions, suggesting that inflammation imposes a harsh environment on these cells, resulting in DNA damage. Pathway enrichment analysis showed that mutations in inflamed tissue were significantly associated with pathways related to epithelial functional impairment due to inflammation.
Unlike ulcerative colitis, fewer mutations in the IL-17 signaling pathway were detected in inflamed tissue from Crohn’s disease patients, indicating a limited role for IL-17 in Crohn’s disease pathogenesis. In contrast, mutations in the IFN-γ and TNF-α signaling pathways were identified, with significant differences in mutation frequency depending on the inflammatory site, particularly in the IFN-γ pathway. These findings suggest that among Th1 cytokines, IFN-γ may drive somatic mutations in intestinal epithelial cells under inflammatory conditions, and that these mutations help epithelial cells adapt to the inflammatory environment. Additionally, patients with persistent inflammation despite anti-TNF treatment had a higher frequency of mutations in IFN-γ-related genes compared to those in remission.
In conclusion, our study confirms that somatic mutations in intestinal epithelial cells in Crohn’s disease are more influenced by Th1 cytokines (IFN-γ, TNF-α) than by IL-17, leading to mutation accumulation in related pathways. Mutations in IFN-γ-related genes are particularly implicated in promoting cellular adaptation and survival in an inflammatory environment, potentially contributing to the persistence of inflammation. These findings suggest that Crohn’s disease patients with IFN-γ related mutations may benefit from therapies targeting the IFN-γ pathway.

국문 초록 (Abstract)

크론병은 만성 염증성 장 질환으로, 위장관 전반에 걸쳐 발생하는 국소적인 염증이 특징이다. 사이토카인은 염증 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, TNF를 표적으로 하는 생물학적 제제가 대표적인 치료법으로 사용되고 있다. 다른 사이토카인을 표적으로하는 약제도 개발되었지만, 크론병에서의 효과는 질병의 이질성으로 인해 불확실하다고 보고되었다.
염증성 장 질환은 원인이 알려지지 않은 난치성 질환으로, 다양한 요인이 그 발병 기전에 기여한다. 쌍둥이 연구를 통해 유전적 소인이 시사되었지만, 생식세포 돌연변이만으로는 크론병의 국소적인 염증과 산발적으로 발생하는 변이의 특성을 완전히 설명할 수 없다.
본 연구는 체세포 돌연변이에 초점을 맞춰 크론병과의 관계를 연구하고자 한다. 최근 연구에 따르면 염증성 장 질환자의 장 상피 오가노이드에서 IL-17A 경로 유전자의 체세포 변이가 확인된 바 있다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 본 연구에서는 염증성 장 질환에 대해 보고된 IL-17 경로 외에도 Th1 세포에서 분비되는 친염증성 사이토카인(IFN-γ, TNF-α)으로 인해 발생한 장 상피 세포의 체세포 변이를 분석하고자 한다. 나아가 변이가 크론병 진행에 기여하는 바와 개인화된 치료 및 처방을 위한 바이오마커로서의 잠재력을 제시하는 것에 목표를 두고 있다.
크론병 환자로부터 염증 부위 49개, 비염증 부위 58개, 관해 부위 9개의 조직샘플을 수집해 심층 전장 엑솜 시퀀싱으로 시퀀싱 데이터를 진행한 데이터를 벤치마킹을 통해 구축한 전용 돌연변이 검출 파이프라인으로 체세포 변이를 검출하였다. 검출 결과 발생한 변이가 염증 조건에서 상피 세포에 비염증 부위에 비해 유의미하게 축적되었으며, 이는 염증이 세포에 가혹한 환경을 조성하여 DNA 손상을 초래함을 시사한다. 더불어 염증 조직에 축적된 돌연변이가 관련된 생물학적인 경로를 보면 상피 세포의 기능과 손상된 경로에 유의미하게 축적된 것을 볼 수 있다.
기존 연구되었던 궤양성 대장염과 달리 크론병은 염증 조직에서 IL-17 신호 경로의 돌연변이가 적게 검출되었으며, 이를 통해 발병기전에서 IL-17의 역할이 제한적임을 알 수 있다. 대조적으로, IFN-γ 및 TNF-α 신호 전달 경로에 발생한 돌연변이를 확인할 수 있었는데, 특히 IFN-γ 경로에 염증 부위에 따른 변이의 유의미한 차이를 확인했다. 결론적으로 Th1 사이토카인 중에서도 IFN-γ가 염증 상황에서 장 상피 세포에 발생하는 변이에 영향을 미칠 것으로 예상되며, IFN-γ 관련 유전자에 돌연변이가 있는 장 상피 세포가 염증 조건에서 적응하는데 도움을 주는 것을 확인했다. 추가적으로 항-TNF 치료에도 불구하고 지속적인 염증이 있는 환자가 관해 상태에 비해 IFN-γ 관련 유전자의 돌연변이를 가지는 경향성을 확인했다.
본 연구 결과에 따르면 크론병의 장내 염증 상황에서 발생하는 장 상피 세포의 체세포 돌연변이는 IL-17보다 Th1 사이토카인(IFN-γ, TNF-α)의 영향을 더 많이 받으며 관련 경로의 유전자에 변이가 축적된 것을 확인했다. 특히 IFN-γ 관련 유전자의 돌연변이가 염증 환경에서 세포 적응과 생존을 촉진하며, 잠재적으로 염증 지속에 기여할 수 있을 것으로 추정된다. 나아가 IFN-γ 관련 돌연변이가 있는 크론병 환자는 IFN-γ 경로를 표적으로 하는 생물학적 제제를 사용할 경우 긍정적인 효과를 기대할 수 있을 것으로 예상된다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 2
• 2. Method 10
• 2.1 Sample collection and associated clinical data 10
• 2.2 Whole exome sequencing 10
• 2.3 Spike-in benchmarking and variant calling method 11
• 2.4 Somatic mutation detection using a dedicated pipeline 12
• 2.5 Mutational pattern and signature analysis 13
• 2.6 Mutation analysis in inflammation-related pathways 13
• 2.7 Pathway enrichment analysis 15
• 2.8 RNA sequencing and differentially expressed gene (DEG) analysis 15
• 2.9 Selective analysis 16
• 2.10 Statistical analysis 16
• 3. Result 18
• 3.1 Sample collection and development of a dedicated pipeline 18
• 3.2 Patterns of somatic mutations during inflammation in Crohn's disease 25
• 3.3 Pathway enrichment analysis of somatic mutations during inflammation in Crohn's disease 32
• 3.4 Distinct IL-17-associated mutation patterns in Crohn's disease and ulcerative colitis 35
• 3.5 Th1 cytokine-driven mutations in intestinal epithelial cells of Crohn's disease 38
• 3.6 Inflammation simulation reveals cytokine-driven genetic alterations and RNA expression changes in human normal organoids 46
• 3.7 Analysis of mutation differences in Crohn's disease inflammation outcomes based on anti-TNF treatment response 52
• Discussion 56
• References 59
• 논문요약 68