Protective effects of deacetylasperulosidic acid on Atopic dermatitis by regulating Th1/Th2 Immune Balance and restoring skin barrier function in HaCaT, HMC-1, and EOL-1 Cells

국문 초록 (Abstract)

이전 연구를 통하여, 발효 노니가 아토피성 피부염을 유발한 동물 모델에서 효능이
있음이 입증되었다. 본 연구에서는 발효 노니로부터 분리된 단일성분의 항아토피 효능 및
기전연구를 통해 효능성분을 규명하고자 하였다. 발효 노니의 HPLC-PDA 분석 결과,
deacetylasperulosidic acid (DAA)와 asperulosidic acid (AA)가 지표성분으로
밝혀졌으므로 아토피성 피부염에 중요한 역할을 하는 각질세포, 비만세포, 호산구 세포를
이용하여 기능(지표)물질을 규명하고자 하였다.
DAA와 AA의 효능을 비교하기 위해 TNF-α 와 IFN-γ 처리한 인간 각질세포주
HaCaT 세포에서 생산되는 TSLP 와 IL-33의 분비량, PMACI를 처리한 인간 비만세포주
HMC-1 세포에서 생산되는 histamine과 IL-4의 분비량, HDM 처리된 인간
호산구세포주 EOL-1 세포에서 생산되는 MCP-1 과 IL-5의 분비량을 비교하였다.
DAA와 AA는 세 세포주 모두에서 아토피성 피부염과 관련된 사이토카인 및 케모카인을
유사하게 억제하였다. DAA와 AA의 최고농도에서 임상 치료제로 사용되는
dexamethasone (DEX)와 유사한 효능을 보였다. 따라서, 함량이 가장 많고 발효에
의해서도 함량이 상대적으로 높아지는 DAA를 기능(지표)성분으로 선정하였다.
DAA를 이용하여 항아토피 효능을 규명하기 위해 세 세포에서 아토피성 피부염과
관련된 사이토 카인 및 케모카인의 발현 및 분비 수준을 비교하였다. DAA는 HaCaT
세포에서 IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, MCP-1 유전자 발현 및 분비를 억제하였다. 또한,
Th2 세포의 직간접적인 활성과 관련된 IL-25, TARC, MDC, RANTES의 유전자 발현 및
분비를 억제하였다.
DAA는 HMC-1 세포에서 아토피성 피부염과 관련된 IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α,
TSLP, 및 MCP-1의 유전자 발현 및 분비를 억제하였다. EOL-1 세포에서도 IL-6, IL-8,
TNF-α 및 MCP-1의 유전자 발현 및 분비를 억제하여 항아토피 효능을 나타냄을
규명할 수 있었다.
DAA의 작용기전을 규명하기 위해 HaCaT, HMC-1, 및 EOL-1 세포에서 MAPK
pathway에 관여되는 ERK, JNK, P38의 인산화 비율을 비교하였으며 NF-kB의 발현
정도를 비교하기 위해 IkBα의 분해 및 핵내로의 NF-kB의 전위를 비교하였다. DAA는 세
세포 모두에서 MAPK pathway 및 NF-kB의 발현 억제를 통해 항 아토피 효능을
나타냄을 규명할 수 있었다.
임상적으로 가장 많이 사용되는 스테로이드 치료제의 단점인 피부장벽 손상에 대한
효능을 보기 위해, DAA가 HaCaT 세포에서 피부장벽기능을 담당하는 filaggrin (FLG) 및
involucrin (IVL)의 단백질 발현에 대해 어떤 영향을 주는 지를 확인하였다. DEX는 FLG
및 IVL의 발현 수준을 회복시키지 못한 반면, DAA는 농도의존적으로 증가시켰으며
최고농도에서 정상치로 회복시켰다.
결론적으로 DAA는 Th1/Th2 면역 불균형의 회복 및 피부장벽 기능의 개선을 통해
부작용이 적은 아토피 성 피부염의 신약개발 후보 물질이 될 수 있음을 시사하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The medicinal plant Noni (Morinda citrifolia) is widely dispersed throughout Southeast Asia, the Caribbean, and Australia. We previously reported that fermented Noni could alleviate atopic dermatitis (AD) by recovering Th1/Th2 immune balance and enhancing skin barrier function induced by 2,4-dinitrochlorobenzene. Noni has a high deacetylasperulosidic acid (DAA) content, whose concentration further increased in fermented Noni as an iridoid constituent. This study aimed to determine the anti-AD effects and mechanisms of DAA on HaCaT, HMC-1, and EOL-1 cells. DAA inhibited the gene expression and secretion of AD-related cytokines and chemokines including interleukin (IL)-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-25, IL-33, thymic stromal lymphopoietin, tumor necrosis factor-alpha, monocyte chemoattractant protein-1, thymus and activation-regulated chemokine, macrophage-derived chemokine, and regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted, in all cells, and inhibited histamine release in HMC-1 cells. DAA controlled mitogen-activated protein kinase phosphorylation levels and the translocation of nuclear factor-kappa light chain enhancer of activated B cells into the nucleus by inhibiting IκBα decomposition in all the cells. Furthermore, DAA increased the expression of proteins involved in skin barrier functions such as filaggrin and involucrin in HaCaT cells. These results confirmed that DAA could relieve AD by controlling immune balance and recovering skin barrier function.

목차 (Table of Contents)

• LIST OF FIGURES 1
• LIST OF TABLES 4
• ABSTRACT 5
• 1 INTRODUCTION 7
• 1.1. Atopic dermatitis (AD) 9
• 1.2. Morinda citrifolia (Noni) 11
• 2 MATERIALS 12
• 2.1. Reagent 12
• 2.2. Instruments 13
• 3. METHODS 14
• 3.1. Preparation of experimental material 14
• 3.1.1. Preparation of fermented Noni extract (F.noni) 14
• 3.1.2. Quantification of DAA and AA by HPLC-PDA analysis 15
• 3.2. Cell culture 15
• 3.3. Cell viability 16
• 3.4. Cytokine and chemokine analyses 16
• 3.5. Histamine analysis 17
• 3.6. RNA extraction and quantitative real time-polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis 17
• 3.6.1. RNA extraction 17
• 3.6.2. cDNA synthesis and RT-qPCR 18
• 3.7. Protein extraction and western blotting 20
• 3.7.1. Protein extraction 20
• 3.7.2. Western blotting 21
• 3.8. Statistical analysis 21
• 4. RESULTS 22
• 4.1. HPLC-PDA chromatogram of Noni and F.noni 22
• 4.2. DAA and AA inhibit the secretion of AD-related inflammatory cytokines and chemokines in HaCaT cells 24
• 4.3. DAA and AA inhibit the secretion of AD-related inflammatory cytokines and chemokines in HMC-1 cells 26
• 4.4. DAA and AA inhibit the secretion of AD-related inflammatory cytokines and chemokines in EOL-1 cells 28
• 4.5. DAA inhibits the secretion of AD-related cytokines and chemokines increased by TNF-α and IFN-γ in HaCaT cells 30
• 4.6. DAA inhibits the gene expression levels of AD-related cytokines and chemokines increased by TNF-α and IFN-γ in HaCaT cells 32
• 4.7. DAA inhibits AD-related cytokines and chemokines known to activate Th2 cells secreted by HaCaT cells treated with TNF-α and IFN-γ 33
• 4.8. DAA inhibits the gene expression levels of AD-related cytokines and chemokines known to increase Th2 activity in HaCaT cells treated with TNF-α and IFN-γ 35
• 4.9. DAA inhibits the MAPK phosphorylation and NF-κB activation increased by TNF-α and IFN-γ in HaCaT cells 36
• 4.9.1 Effect of DAA on the MAPK pathway in HaCaT cells. 36
• 4.9.2 Effect of DAA on the NF-kB pathway in HaCaT cells. 37
• 4.10. DAA increases the expression of skin barrier proteins reduced by TNF-α and IFN-γ in HaCaT cells 38
• 4.11. DAA inhibits the secreted levels of AD-related cytokines and chemokines increased by PMACI in HMC-1 cells 40
• 4.12. DAA inhibits the gene expression levels of AD-related cytokines and chemokines increased by PMACI in HMC-1 cells 41
• 4.13. DAA inhibits MAPK phosphorylation and NF-κB activation increased by PMACI in HMC-1 cells 43
• 4.13.1 Effect of DAA on the MAPK pathway in HMC-1 cells. 43
• 4.13.2 Effect of DAA on the NF-kB pathway in HMC-1 cells. 44
• 4.14. DAA inhibits the secretion of AD-related cytokines and chemokines increased by HDM in EOL-1 cells 45
• 4.15. DAA inhibits the gene expression of AD-related cytokines and chemokines increased by HDM in EOL-1 cells 46
• 4.16. DAA inhibits MAPK phosphorylation and NF-κB activation increased by HDM in EOL-1 cells 47
• 4.16.1 Effect of DAA on the MAPK pathway in EOL-1 cells. 47
• 4.16.2 Effect of DAA on the NF-kB pathway in EOL-1 cells. 48
• 5 . DISCUSSION 50
• 6. CONCLUSION 56
• 7. REFERENCE 57
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