Determination of integral stereoselectivity on medium-chain triacylglycerol hydrolysis with interface-based kinetic model = 계면 기반 동역학 모델을 통한 중쇄지방 가수분해 반응의 통합적 입체선택성 결정

국문 초록 (Abstract)

본 논문에서는 기존 입체선택성 분석법의 한계를 극복하기 위해 도입된 통합적 입체선택성을 저열량 지방과 빠른 에너지원으로의 가치를 지닌 중쇄지방에 적용하기 위해 대표적인 중쇄지방인 트라이카프릴로일글리세롤(TCG)에 대한 라이페이스의 통합적 입체선택성을 구명할 수 있는 분석법과 동역학 모델을 구축하였다. CHIRALPAK AY-3 칼럼을 이용한 HPLC-UV/ELSD 시스템을 통해TCG와 그의 가수분해 산물인 모든 종류의 다이카프릴로일글리세롤(DCG)과 모노카프릴로일글리세롤(MCG) 이성질체를 직접적인 방식으로 동시에 분리하였다. 15 분의 분석시간내에 모든 분석물이 2.4 이상의 높은 분리능으로 분리되었다. 구축된 분석법으로 돼지 췌장, Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens 유래 라이페이스 및 Candida antarctica 유래 라이페이스 A를 이용하여 역미셀계에서의 TCG 가수분해 반응을 분석하였다. 분석 결과 4가지 라이페이스 모두 이전에 보고된 것과 동일한 선택성을 보여 구축된 방법이 TCG 가수분해를 분석하기에 정확하며 효율적임이 입증되었다. 분석결과를 통해 라이페이스의 통합적 입체선택성을 정량적으로 나타내기 위해 새로운 계면 기반 동역학 모델을 구축하였다. 계면 기반 동역학 모델은 이전 연구에서 구축된 동역학 모델을 기반으로 반응물과 생성물 및 효소의 계면에서의 작용을 추가적으로 고려하여 구축되었다. 계면 기반 동역학 모델을 통해 산출된 예상값은 TCG, DCG, MCG 및 CA의 반응곡선을 이전 모델(R2>0.94)에 비해 더 우수하게 예측하였다(R2>0.98). 또한 산출된 동역학 상수를 비교하였을 때 TCG에서 DCG로의 속도를 나타내는 동역학 상수의 대소관계는 4가지 모델 라이페이스의 선택성과 일치하였다. 추가적으로 DCG와 MCG에 대한 동역학 상수를 통해 TCG부터 글리세롤까지 각 라이페이스들의 주 반응경로를 확인할 수 있었다. 결론적으로 중쇄지방에 대한 통합적 입체선택성을 구명하기 위해 구축된 분석법과 동역학 모델은 라이페이스를 통한 반응을 분석하고 연구하는데 도움을 주어 저열량 지질과 같은 영양학적 가치가 높은 중쇄지방 기반 재구성 지질 개발 및 생산에 큰 보탬이 될 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Lipase is an enzyme that hydrolyzes triacylglycerol and is used in various fields such as food, medicine, and cosmetics. An important characteristic of lipase-catalyzed hydrolysis of triacylglycerol (TAG) is that lipase exhibits a different preference for the sn-position of the glycerol backbone. The stereoselectivity of lipases on TAG has been evaluated by measuring the ratio of diacylglycerols (DAGs) produced at the early phase of the reaction. However, the conventional methods have a limitation in that it does not consider the stepwise hydrolysis reaction of acylglycerols, i.e., the conversion of diacylglycerol to monoacylglycerol (MAG) and glycerol, and acyl migration between acylglycerol isomers. To overcome these limitations, the concept of integral stereoselectivity was suggested, which considers the entire process of TAG hydrolysis reaction with trioleoylglycerol (TOG) as a model substrate. In recent years, the utilization of medium-chain triacylglycerol (MCT) has gained much attention in food industry because it can be used as low-calorie lipids. Therefore, in this study, an analytical method to determine the integral stereoselectivity of lipases on MCT was established using tricapryloylglycerol (TCG), a representative MCT as a substrate. The method to simultaneously analyze TCG and its hydrolysis products was constructed through the HPLC-UV/ELSD system. During a short analysis time of 15 min, a total of 8 analytes including all capryloylglycerols were clearly separated with a separation factor of 2.4 or higher. Subsequently, the TCG hydrolysis by lipase was carried out through four model lipases: lipase from porcine pancreas (PPL), Pseudomonas fluorescens (PFL), Chromobacterium viscosum (CVL), and lipase A from Candida antarctica (CALA) representing the different stereoselectivity (sn-1,3, sn-1, sn-3, and sn-2, respectively). A novel interface-based kinetic model was constructed to determine integral stereoselectivity by considering the interfacial characteristics of lipases and components in reverse micelle based on the previous kinetic model. The interface-based kinetic model has improved the accuracy of data fitting (R2>0.98) compared to the previous kinetic model (R2>0.94). From kinetic parameters calculated from the kinetic modeling, the main reaction pathways of TCG hydrolysis were from TCG to 1,2-sn or 2,3-sn-DCG and then 2-sn-MCG for PPL, PFL, and CVL, while for CALA that was from TCG to 1,3-sn-DCG to 1-sn and 3-sn-MCG. In conclusion, this study developed the analytical method and the interface-based kinetic model that enable the determination of integral stereoselectivity on MCT. Through these advancements, the present study provides stereochemical information of lipase on a wider substrate as well as long-chain TAG, which would accordingly contribute valuable insights into the utilization of MCT and lipases to produce a wide range of structured lipids in the food industry.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and methods 6
• 2.1. Materials 6
• 2.2. Preparation of monocapryloylglycerols 7
• 2.3. Chiral HPLC system 7
• 2.4. Tricapryloylglycerol hydrolysis in reverse micelle 9
• 2.4.1. Determination of optimum reaction condition 9
• 2.4.2. Tricapryloylglycerol hydrolysis for HPLC analysis 10
• 2.5. Kinetic modeling 11
• 2.5.1. Establishment of the interface-based kinetic model 11
• 2.5.2. Fitting of the kinetic model 26
• 3. Results and discussion 28
• 3.1. Separation and quantification of capryloylglycerol species and caprylic acid 28
• 3.2. Stereoselectivity of model lipases 36
• 3.3. Fitness of kinetic model without interfacial characteristics 48
• 3.4. Integral stereoselectivity of model lipases with interface-based kinetic model 58
• 4. Conclusions 73
• 5. References 74
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