Surface-enhanced Raman scattering-based chemical sensor utilizing silver nanoparticles assembled on silica nanoparticles = 화학 센서를 위한 표면 증강 라만 산란 기반의 은 나노입자 어셈블 실리카 나노입자

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

With the development of industry, agriculture and public utilities, varieties of chemicals generated are rapidly increasing, and they infiltrate into surrounding environment such as air, water, and soil, as well as food and daily necessities. Various techniques including colorimetry, fluorescence, gas chromatography-mass spectrometry, liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS / MS), and high performance liquid chromatography (HPLC) have been developed to ensure detecting and monitoring the metabolism and transformation of these substances in trace amount. Although being the most robust, popular, and reliable method, HPLC required a harsh solvent, high-power source, complex multi-step pre-treatment process, bulky and sophisticated operation, and trained personnel. It is also time-consuming and expensive. Hence, a rapid, simple, highly sensitive, selective, accurate, stable, and multiple detection method should be developed for the determination of these substances in trace amount.
Surface-enhanced Raman scattering, called SERS, was emerged in recent years as an attractive analytical technique for detecting specific substances. It is a simple, easy-handle, cost-effective, fingerprinting, non-destructive, sensitive, and selective method. Various metal nanostructures including silver nanostructures, gold nanostructures and bi-metallic nanostructure have been prepared as substrates to increase the enhancement factor of SERS. However, the single metal nanostructure-based SERS need to improve for quantitative detection. Also, the preparation of reproducible, reliable, and powerful SERS active substrate has been developed to quantitative SERS application. Therefore, a new nanostructure, based on the combination of silica (SiO_(2)) core and silver nanoparticles that called a silver embedded silica nanoparticle (SiO_(2)@Ag), have been successfully synthesized and utilized as a substrate for SERS application in this thesis. As expected, this nanostructure exhibits numerous hotspots on the surface of SiO_(2) nanoparticle to enhance not only the sensitivity but also reproducibility of SERS signals. It is also capable of ultrasensitive quantitative SERS analysis. As a result, the SiO_(2)@Ag was used as a detection component to develop a chemical sensor based on SERS technique.
In Part A of the first chapter, SiO_(2)@Ag was first prepared to detect alternariol (AOH), a major mycotoxin of the genus Alternaria. The SiO_(2)@Ag showed high sensitivity and good linearity (R^(2) = 0.984) of SERS signal and AOH concentration from 16 to 1000 nM with a limit of detection (LOD) of 4.83 nM. The reliability of SERS method was also verified via high reproducibility of SERS signal of the AOH concentration from 10 to 10,000 nM to be from 2.33 to 5.95%.
In Part B, ligands were introduced on the surface of SiO_(2)@Ag to achieve the selectivity of SERS signal. Mono-6-deoxy-6-aminopropylamino-β-cyclodextrins were modified on the surface of SiO_(2)@Ag as a ligand to prepare pr-β-CD-functionalized SiO_(2)@Ag (SiO_(2)@Ag@pr-β-CD). For application, SiO_(2)@Ag@pr-β-CD had been used to recognize specific flavonoid among various flavonoids (quercetin, myricetin, naringenin and apigenin). SiO_(2)@Ag@pr-β-CD was able to detect quercetin corresponding to the LOD as low as 0.55 ppm. The relationship between the logarithm of the Que concentration and the Raman intensity of SiO_(2)@Ag@pr-β-CD showed good linearity in the range of 3.4 to 33.8 ppm (R^(2) = 0.997). The presence of pr-β-CD on the SiO_(2)@Ag surface indicates improving selectivity by showing that it captures quercetin or myricetin amongst other similar materials (naringenin and apigenin).
The main issues in developing quantitative analysis methods by uilizing SERS spectroscopy are the preparation of reliable SERS-active substances such as nanoparticle-based structures and the acquisition of the SERS signal without any disturbance which may change the SERS signal intensity and frequency. In the last chapter, for this, the seamless multi-layered core-shell nanoparticles with an embedded Raman label compound (RLC) as an internal standard (ML_(RLC) dots) was fabricated for quantitative SERS analysis. The SERS signal of the internal standard in the ML_(RLC) dots serves as a reference value to calibrate the SERS signal of the analyte. By using the ML_(RLC) dots, the SERS signal of target analyte was obtained at various concentrations while the SERS signal of the internal standard retained. Also, a ratiometric strategy used in the analysis, was proven to be practical through normalization of the relative SERS intensity. For application, the ML_(4‑BBT) dots with 4-bromobenzenethiol (4-BBT) as an internal standard are successfully applied for the quantitative analysis of 4-fluorobenzenethiol (4-FBT) and thiram. The concentration of 4-FBT estimated through 3-D calibration SERS curve showed an accuracy of less than 10% deviation. The lowest detectable amounts of thiram per apple peel was up to 24 ng·cm^(-2) in the application of ML_(4-BBT) dots
In general, the results suggest that strategies utilizing the assembled nanostructure, the ligands, internal standard and ratiometric analysis open a new approach to develop a highly precise and accurate chemical sensors based on SERS technique in our research.

국문 초록 (Abstract)

산업의 발전과 함께 사용되는 화학 물질의 수와 양이 빠르게 증가하며, 많은 화학물질들이 식품 및 생활용품뿐만 아니라 공기, 물 및 토양과 같은 사람을 둘러싼 모든 환경에 스며들었다. 이러한 화학물질의 대사 및 변형을 모니터링하기 위해, 미량으로도 이들을 탐지 할 수 있는 비색법 (colorimetry), 형광 (fluorescence), 가스 크로마토그래피-질량 분석법 (GS-MS), 액체 크로마토그래피-직렬 질량 분석법 (LC-MS / MS) 및 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 포함한 다양한 기술들이 개발되었다. 그 중 HPLC는 가장 널리 이용되며 신뢰할 수 있는 방법이지만, 고전력의 부피가 큰 장치이며 복잡한 다단계 전처리 공정 및 정교한 제어를 할 수 있는 숙련된 인력이 필요하다. 또한 분석에 시간과 비용이 많이 소비된다. 따라서, 미량으로 이들 물질을 측정 시 빠르고 간단하며 매우 민감하고 선택적이고 정확하며 안정적이며 다중 검출가능한 기술을 개발할 필요가 있다.
표면증강라만산란 (SERS) 분광법은 최근 특정 물질을 탐지하기 위한 매력적인 분석 기법으로 등장했다. 이는 물질 고유의 라만 신호를 나노금속입자의 표면처리를 통해 국소 표면 플라즈몬 공명 (Localized Surface Plasmon Resonance, LSPR) 효과를 활용하여 크게 증폭시켜 초고감도 소량 검출이 가능하다. 또한 라만 신호는 수분에 의한 영향을 받지않고, 시간과 온도 및 습도 등의 환경에 덜 민감하며, 매우 좁은 선폭의 광학신호를 가져 다중 검출이 가능하다. 그리고 복잡한 전처리 공정없이 간단히 측정 가능하며 샘플 비파괴적 측정이 가능하다는 장점이 있어 의료, 바이오, 농식품, 환경 등 여러분야에서 차세대 고감도 검출·진단·분석 기술로 주목받고 있다.
SERS의 향상 인자 (enhance factor)를 증가시키기 위해 은과 금 및 이중 금속 등을 활용한 다양한 금속 나노 입자가 기판으로서 제조되었다. 여러 SERS 기판 중 실리카 (SiO_(2)) 코어와 은 나노 입자의 조합에 기초한, 은 나노 입자가 표면에 조립된 실리카 나노 입자 (SiO_(2)@Ag)가 제조되었다. 이 나노 구조는 실리카 나노 입자 표면에 많은 은 나노 입자가 조립되어 나노-갭을 형성하여, 수많은 “핫스팟”을 가지게 되고 이를 통해 초 고감도 SERS 분석이 가능하다. 이 논문에서는 SiO_(2)@Ag를 SERS 기술에 기초한 화학센서를 개발하기 위한 기판으로 사용하였다.
첫 번째 장의 파트A에서, SiO_(2)@Ag가 Alternaria 속의 주요 mycotoxin 인 alternariol (AOH)를 검출하기 위해 준비되었다. SiO_(2)@Ag는 16~1000 nM의 AOH 농도에서 검정곡선의 결정계수 R^(2)이 0.984로 좋은 선형성과 4.83 nM의 검출한계 (LOD)를 보여주며 SERS 신호의 높은 감도를 나타내었다. 또한 10 ~ 10,000 nM의 AOH 농도에서 2.33 ~ 5.95%의 높은 SERS 신호 재현성을 보여주며 신뢰성을 검증하였다. 파트B에서는 나노입자의 화학물질의 선택적 흡착 또는 결합이 가능하도록, SiO_(2)@Ag의 표면에 리간드를 도입하였다. 리간드로는 mono-6-deoxy-6-aminopropylamino-β-cyclodextrin가 사용되었다. 제조된 SiO_(2)@Ag@pr-β-CD (mono-6-deoxy-6-aminopropylamino-β-cyclodextrin이 도입된 SiO_(2)@Ag)는 유사한 구조를 지닌 다양한 플라보노이드 (쿼세틴 (quercetin), 미리세틴 (myricetin), 나린제닌 (naringenin) 및 아피제닌 (Apigenin)) 중에서 특정 플라보노이드를 구별하는지 알아보았고 그 결과, SiO_(2)@Ag 표면 상의 pr-β-CD의 존재는 플라보노이드에 속하는 유사한 물질들 (쿼세틴, 미리세틴, 나린제닌 및 아피제닌) 중에서 쿼세틴과 미리세틴에 대한 선택성이 향상됨을 확인하였다. 특히 SiO_(2)@Ag@pr-β-CD는 쿼세틴 검출에서 0.55 ppm의 LOD를 보여주었고 3.4 ~ 33.8ppm (R^(2) = 0.997) 범위의 선형성을 유지하였다.
SERS 분광법을 사용한 정량 분석 방법 개발에서 중요한 것은 신뢰할 수 있는 SERS 활성 기판의 제조와 방해없는 SERS 신호의 획득입니다. 이를 위해, 두 번째 장에서는 내부 표준으로서 라만 표지 화합물이 내장된 다층 금속나노입자 구조체 (ML_(RLC) dots)를 제조 하였다. ML_(RLC) dots에서 내부 표준의 SERS 신호는 분석 물질의 SERS 신호를 교정하기위한 기준 값을 제공한다. 제조된 ML_(RLC) dots에서 분석물의 SERS 신호와 내부 표준의 SERS 신호는 서로 독립적임을 확인하였다. ML_(RLC) dots는 실용적 임이 증명된 비율 측정 전략 (ratiometric analysis)과 함께 정량 분석에 사용되었다. 4-bromobenzenethiol (4-BBT) 을 내부 표준물질로 포함하는 ML_(4-BBT) dots는 나노 입자 양에 따른 내부표준 신호의 변화에서 높은 선형성 (R^(2) = 0.997)과 낮은 표준편차 (~ 5.3%)를 보였고, 분석물 농도에 따른 분석물질 및 내부표준의 신호비율 분석을 통하여 4-fluorobenzenethiol (4-FBT)의 정량 분석에 성공적으로 적용되었다. 정량분석된 4-FBT의 농도는 실제 농도와 10 % 미만의 정확도를 보여주었다. 또한 ML_(4-BBT) dots을 사용하여 사과껍질에서 살충제인 티람 (thiram)을 검출한 결과, 24 ng/cm^(2)까지 검출 가능하였다. 이는 10^(-8) mol/mL의 10 μL 에 해당하는 티람을 검출한 것으로 국립산업안전 보건연구소에서 정한 치사농도 (LC_(50)) 인 500 μg/mL 보다 낮은 수치이다.
이 결과들은 금속나노입자가 코어나노입자표면에 조립된 나노 구조, 리간드, 내부 표준 및 비율 측정 분석을 활용 한 전략이 SERS 기술을 기반으로 매우 정밀하고 정확한 화학 센서를 개발하기위한 새로운 접근 방법을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Introduction 1
• 1.1. Surface-enhanced Raman scattering 1
• 1.2. Silver nanoparticles assembled on silica nanoparticles 10
• 1.3. Thesis of scope and outline 12
• Chapter 1. Surface- enhanced Raman scattering (SERS)-based detection with intrinsic approach using silver nanoparticles assembled on silica nanoparticles 14
• 1.1. Part A. Label-free detection of alternariol : Highly reproducible surface-enhanced Raman scattering detection of alternariol using silver nanoparticles assembled on silica nanoparticles 14
• 1.1.1. Introduction 14
• 1.1.2. Materials and Methods 16
• 1.1.2.1. Materials 16
• 1.1.2.2. Synthesis of silver nanoparticles assembled on silica nanoparticles (SiO_(2)@Ag) 16
• 1.1.2.3. Immobilization of alternariol (AOH) on SiO_(2)@Ag 17
• 1.1.2.4. Measurement of transmission electron microscopy (TEM) 17
• 1.1.2.5. Measurement of UV-Vis Spectroscopy 17
• 1.1.3. Results and Discussion 18
• 1.1.3.1. Characterization of SiO_(2)@Ag 18
• 1.1.3.2. SERS activity of SiO_(2)@Ag for AOH detection 20
• 1.1.3.3. SERS detection of AOH 23
• 1.1.3.4. Reproducibility of SERS intensity of SiO_(2)@Ag reacted with AOH 27
• 1.1.4. Conclusions 30
• 1.2. Part B. Selective detection utilizing capturing ligand : Mono-6-deoxy-6-aminopropylamino-β-cyclodextrin on silver nanoparticles assembled on silica nanoparticle as a selectively capturing ligand to flavonoids 31
• 1.2.1. Introduction 31
• 1.2.2. Materials and Methods 35
• 1.2.2.1. Materials 35
• 1.2.2.2. Preparation of SiO_(2)@Ag 35
• 1.2.2.3. Preparation of mono-6-deoxy-6-aminopropylamino-β-cyclodextrin (pr-β-CD) 36
• 1.2.2.4. Preparation of pr-β-CD functionalized SiO_(2)@Ag 36
• 1.2.2.5. Incubation of SiO_(2)@Ag@pr-β-CD with flavonoids 37
• 1.2.2.6. Characterization of pr-β-CD functionalized SiO_(2)@Ag by TEM and UV-Vis absorption spectroscopy 37
• 1.2.2.7. Raman measurement 37
• 1.2.3. Results and Discussion 38
• 1.2.3.1. Schematic illustration of this research 38
• 1.2.3.2. Synthesis and characterization of SiO_(2)@Ag@pr-β-CD 40
• 1.2.3.3. The effect of pr-β-CD on the surface of SiO_(2)@Ag 45
• 1.2.3.4. Selectivity of the SiO_(2)@Ag@pr-β-CD for flavonoids 47
• 1.2.3.5. The dynamic linear range of quercetin (Que) in detection using SiO_(2)@Ag@pr-β-CD 49
• 1.2.4. Conclusion 52
• Chapter 2. Multi-layer SERS nanoprobe and ratiometric analysis based on dual-function internal standards for quantitative detection 53
• 2.1. Introduction 53
• 2.2. Materials and Methods 56
• 2.2.1. Materials 56
• 2.2.2. Preparation of multi-layer SERS nanoprobe (ML_(RLC) dots) 56
• 2.2.3. Characterization of ML_(RLC) dots by TEM, EDX, DLS, and UV-Vis absorption spectroscopy 57
• 2.2.4. Raman measurement 57
• 2.3. Results and Discussion 58
• 2.3.1. Preparation of ML_(RLC) dots 58
• 2.3.2. Characteristics of ML_(RLC) dots 60
• 2.3.3. A study on the dispersion stability of ML_(RLC) dots 66
• 2.3.4. SERS activity of ML_(RLC) dots 68
• 2.3.5. Quantitative accuracy evaluation 70
• 2.3.6. Application of ML_(RLC) dots 75
• 2.4. Conclusions 78
• References 79
• Appendix 96
• Abstract (in Korean) 97