다이옥신 유발 AhR-매개 독성 방어 활성을 가진 생약재의 탐색 = Screening of medicinal plants with inhibitory activity against the AhR-mediated toxicity induced by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin

국문 초록 (Abstract)

2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo -p-dioxin(TCDD)는 polyhalogenated aromatic hyrocarbon계 화합물로서 dioxin류 중 가장 독성이 강한 화합물로 알려져 있으며 현재에도 쓰레기 소각장, 자동차 매연, 펄프 제지공장 등에서 계속 배출되고 있다. 이들은 지용성이 매우 강하며 자연계에서 거의 분해되지 않으므로 먹이사슬을 통해 생체 지방조직에 축적되어 생명체에 악영향을 미치는 환경오염물질이다. 또한 이들 물질은 발암성을 지니고 있고 급성, 만성, 면역, 유전 등 폭넓은 분야에 강한 독성을 나타내고 있어 관심이 매우 높은 물질 중 하나이다.
이에 본 논문에서는 초기검색 방법으로 생물학적 분석법인 CAFLUX (chemically activited fluorescent gene expression)법을 이용하여 dioxin의 생체 내 반응 매개체로 알려진 AhR (aryl hydrocarbon receptor)에 저해물질을 탐색하였고, AhR에 저해 효과가 나타난 생약시료를 가지고 활성 화합물을 분리하여 독성 완화 정도를 확인하기 위해, human hepatocyte cell line인 HepG2 cell에 dioxin과 처리한 후 AhR, AhRR, ARNT, NQO1 그리고 CYP1A1의 mRNA 발현량을 분석하였다.
먼저 CAFLUX법을 이용하여 400개 생약시료의 AhR 유도활성을 측정한 결과, 최종농도 100㎍/㎖에서 dioxin에 의해 유도된 AhR 활성을 30% 이상 저해시키는 7종의 생약을 선발하였다. 그 중에서 CA1-19 CHCl₃분획에서 농도 의존적으로 dioxin에 의해 유도된 AhR의 활성을 저해하는 것으로 나타났으며, 이로부터 하나의 활성 화합물 compound 1을 분리하였다. 이 화합물은 dioxin 작용기작에 관련된 여러 유전자의 mRNA 발현량을 측정한 결과, dioxin에 의해 유도된 AhR, AhRR, ARNT, NQO1 그리고 CYP1A1 mRNA 발현량을 농도 의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 이는 dioxin 독성작용을 완화시키는데 가능성이 있는 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) is one of the most potent toxins and tumor promoters known to man. It is prototype of polyhalogenated aromatic hydrocarbons that occurs as highly persistent environmental contaminants. 2,3,7,8-TCDD exposure in experimental animals results in an array of tissue and species-specific responses, including the following: hepatotoxicity, immunotoxicity, dermal toxicity, carciongenicity, teratogenicity, and neurobehavioral, endocrine, and other biochemical alterations. Recent studies have demonstrated that an oxidative stress occurs in various tissues of 2,3,7,8-TCDD-treated animals.
In this study, we performed a preliminary screening of the inhibitory effects of medicinal plants on 2,3,7,8-TCDD - induced activation of AhR using the AhR-based bioassay for dioxins, the CAFLUX assay. In addition, we attempted isolation of AhR inhibitor from medicinal plant with inhibitory effect. And there RNA was prepared to measure the AhR, AhRR, ARNT, NQO1 and CYP1A1 mRNA expression.
Using the CAFLUX bioassay, we inverstigate the inhibitory effects of 400 medicinal plants on AhR-mediated activity induced by dioxin. Seven kinds of medicinal showed above 30% inhibitory effects whit concentration of 100㎍/㎖. Among the 7 medicinal plants, just CA1-19 CHCl₃showed signficantly inhibitory effects on AhR-mediated activity induced by dioxin. We isolated one active compound 1 thought active-guided fractionation from CA1-19 CHCl₃. Also, in results of AhR, AhRR, ARNT, NQO1 and CYP1A1 mRNA expression, HepG2 cells treated with TCDD sinificantly increased the AhR, AhRR, ARNT, NQO1 and CYP1A1 mRNA expression. However, these decreased mRNA expression were diminished by the treatment of compound 1 in HepG2 cells. In summary, it has been suggested that compound 1 may be able to alleviate toxicity induced by dioxin.

목차 (Table of Contents)

• 표목차 = ⅲ
• 그림목차 = ⅳ
• 국문초록 = ⅶ
• 1. 서론 = 1
• 2. 연구사 = 3
• 2.1 Dioxin류의 화학적 구조 = 3
• 2.2 Dioxin류의 환경적 경로 = 5
• 2.3 Dioxin류의 독성 기전 = 7
• 2.4 Dioxin류의 독성 등가 계수 = 10
• 2.5 Bioassay = 12
• 3. 실험 재료 및 방법 = 16
• 3.1 실험 재료 = 16
• 3.2 생약으로부터 활성물질 분리 정제 = 17
• 3.2.1 생약의 추출 및 분획 = 17
• 3.2.2 물질 분리 = 17
• 3.3 CAFLUX bioassay = 20
• 3.4 MTT assay = 22
• 3.5 유전자 발현 분석 = 23
• 3.5.1 RNA 추출 = 23
• 3.5.2 cDNA 합성 = 24
• 3.5.3 RT-PCR = 24
• 3.6 통계분석 = 25
• 4. 결과 및 고찰 = 26
• 4.1 생약으로부터 dioxin 유도에 의해 활성된 AhR 저해 효과 탐색 = 26
• 4.2 생약으로부터 dioxin 유도에 의해 활성된 AhR 저해 물질 분리정제 = 28
• 4.3 Compound 1 처리에 따른 dioxin 관련 유전자들의 발현량 변화 = 45
• 참고문헌 = 54
• ABSTRACT = 66