MCP1-miR-124 축의 알레르기 염증 조절 기능 연구 = MCP1-miR-124 axis regulates allergic reactions

국문 초록 (Abstract)

MCP1은 알레르기성 염증 반응 동안 발현이 증가하는 것으로 알려져 있으나, 알레르기성 염증에서의 정교한 기능적 역할은 아직 충분히 규명되지 않았다. 본 연구에서는 항원 자극이 rat basophilic
leukemia(RBL-2H3) 세포에서 MCP1 발현을 농도 및 시간 의존적으로 증가시킴을 확인하였다. 또한 AKT와 ERK 신호전달 경로가 항원 자극에 의해 유도되는 MCP1 발현 증가에 필수적임을 규명하였다. MCP1 발현을 억제할 경우 in vitro 알레르기 반응이 감소하였고, 항원 자극에 의해 증가하는 활성산소종(ROS) 생성 또한 억제되었다.
TargetScan 분석을 통해 miR-124가 MCP1의 음성 조절자로 예측되었으며, 실제로 miR-124 mimic은 in vitro 알레르기 반응과 수동피부아나필락시스(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)를 유의하게 억제 하였다. MCP1의 수용체 CCR2의 길항제인 RS504393 역시 알레르기 반응을 저해하고, 항원 자극으로
감소한 miR-124 발현을 회복시켰다. MCP1의 추가적인 조절 인자를 발굴하기 위해 FDA 승인 약물 라이브러리를 스크리닝한 결과, Bcr-Abl
티로신 키나아제 억제제인 닐로티닙(nilotinib)을 MCP1의 잠재적 음성 조절 물질로 확인하였다. 분자 도킹 분석에서는 닐로티닙이 CCR2에 결합할 수 있음을 보여주었다. 닐로티닙은 항원 자극된 RBL-2H3 세포에서 MCP1 발현을 감소시키는 동시에 miR-124 발현을 회복시켰으며, PCA 반응도 유의하게 억제 하였다.
또한 알레르기성 염증에서의 미토콘드리아 기능을 확인한 결과, 미토콘드리아 전자전달계 복합체 I 억제제인 메트포민(metformin)은 항원 자극에 의해 증가하는 미토콘드리아 ROS와 막 전위를 효과적으로 억제하였다. MCP1은 항원 자극된 RBL-2H3 세포에서 ATP 생성 및 ATP citrate synthase 활성에 필수적인 요소로 작용했으며, 재조합 MCP1 단백질은 항원 비의존적으로 ATP citrate synthase 활성을 증가시켰다.
종합적으로 본 연구는 MCP1–miR-124 축이 알레르기성 염증을 조절하는 핵심 경로임을 제시하며, 향후 항알레르기 치료제 개발을 위한 유망한 표적이 될 수 있음을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The role of MCP1 in allergic inflammation has not been studied thoroughly. Antigen stimulation increased the expression of MCP1 in rat basophilic leukemia (RBL2H3) cells in a dose- and time-dependent manner. AKT and ERK were necessary for the increased expression of MCP1 in antigen-stimulated RBL2H3 cells. The downregulation of MCP1 inhibited allergic reactions in vitro and prevented antigen from increasing reactive oxygen species (ROS) levels.
TargetScan analysis predicted miR-124 as a negative regulator of MCP1. The miR-124 mimic negatively regulated allergic reactions in vitro and passive cutaneous anaphylaxis. RS504393, an antagonist of CCR2 (a receptor of MCP1), negatively regulated allergic reactions in vitro and restored the expression of miR-124 in antigen-stimulated RBL2H3 cells.
We screened a library of FDA-approved drugs to identify potential regulators of MCP1. We identified nilotinib, a Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitor, as a possible negative regulator of MCP1. Molecular docking analysis showed the binding of nilotinib to CCR2. Nilotinib decreased the expression of MCP1 but restored the expression of miR-124 in antigen-stimulated RBL2H3 cells. Nilotinib inhibited passive cutaneous anaphylaxis.
We next wanted to examine the role of mitochondria in allergic inflammation. Metformin, an inhibitor of complex I of the mitochondrial electron transport chain, prevented antigen from increasing mitochondrial ROS and mitochondrial membrane potential. MCP1 was necessary for the production of ATP and ATP citrate synthase activity in - 34 antigen-stimulated RBL2H3 cells. Recombinant MCP1 protein increased ATP citrate synthase activity in RBL2H3 cells in an antigen-independent manner. Our results indicate that the MCP1–miR-124 axis can be employed to develop anti-allergy drugs.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 실험재료및실험방법 2
• 1. Chemical and antiboby 2
• 2. Cell culture 2
• 3.Animals 2
• 4. Reactive Oxygen Species Measurement 3
• 5.Transfection 3
• 6.Quantitative Real Time PCR 3
• 7. β-hexosaminidase Activity Assay 3
• 8.miRNA target analysis 4
• 9. Immunoblot and Immunoprecipitation 4
• 10.ATP Citrate Synthase Activity Assays 4
• 11.ATP Production Assays 4
• 12. Passive Cutaneous Anaphylaxis 5
• 13. Structure preparation and virtual screening 5
• 14. Statistical Analysis 5
• Ⅲ. 결과 6
• 1.MCP1은 in vitro 알레르기 반응을 매개함 6
• 2.miR-124는 in vitro 알레르기 반응을 음성적으로 조절함 8
• 3.miR-124 mimic은 in vivo 알레르기 반응을 억제함 10
• 4. C-JUN은 in vitro MCP1 매개 알레르기 반응에 필요함 12
• 5.Nilotinib은 in vitro, in vivo 모두 알레르기 반응을 억제함 14
• 6.Metformin은 ROS 생성을 억제하고 막 전위를 감소시킴 18
• 7.MCP1은 세포 내 ATP 생산에 필요함 20
• 8.Metformin은 수동 피하 아나필락시스 반응을 억제함 22
• Ⅳ. 결론 및 토론 26
• Ⅴ. 참고문헌 28
• Ⅵ. 영문초록 34