애기장대의 MADS-box 단백질과 PRC1 단백질간의 상호작용 분석

국문 초록 (Abstract)

식물의 생장 및 발달 과정 중에서 성공적인 생식은 식물이 후세를 잇기 위한 중요한 과정이다. 이러한 생식 과정은 외부의 다양한 환경 요인들과 내부의 발달 프로그램에 의해 조절된다고 알려져 있다. 특히, 하루 또는 계절적인 온도의 변화는 식물의 생식에 중요한 역할을 미치는 외부 환경 요인 중 하나이다. 모델 식물인 애기장대의 다양한 돌연변이체 및 생태형에 대한 분자 유전학적 연구를 통하여 주변온도 경로 (ambient temperature pathway)가 하나의 식물 개화시기 경로로 확립이 되었다. 특히, 이 개화시기 경로에서 MADS-box 전사조절인자를 암호화하는 MADS-box 관련 유전자인 SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP), FLOWERING LOCUS C (FLC) 및 FLOWERING LOCUS M/MADS AFFECTING FLOWERING1 (FLM/MAF1)가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그리고, 후성유전학 조절 (epigenetic regulation)에 관여하는 다양한 조절인자들도 식물의 개화시기를 조절하는 것으로 알려져 있다. 대표적으로 PRC1 complex 중 하나인 Like Heterochromatin Protein 1/Terminal Flower 2 (LHP1/TFL2) 유전자가 FLOWERING LOCUS T (FT) 유전자를 비롯한 여러 개화시기 유전자들의 발현을 억제한다. 최근의 보고에 따르면 SVP 단백질과 LHP1/TFL2 단백질의 상호작용에 의해 식물의 꽃 발달이 조절된다고 알려져 있다. 이러한 결과는 대기온도 감지경로에서 후성유전학 조절 기작이 관여할 가능성을 제시한다. 따라서, 본 연구에서는 식물 발달 과정의 주요 조절자로 작용하는 PRC1 관련 단백질 (LHP1/TFL2, AtRING1A/B, AtBMI1A/B/C)과 온도 반응 개화시기 조절에 있어 중요한 역할을 하는 MADS-box 단백질 (SVP, FLM, FLC)간의 분자 생물학적, 유전학적 및 생화학적 상호작용 기작을 밝히고자 하였다.
첫번째로 16℃와 23℃에서 생장한 야생형 (Col-0) 애기장대와 여러 PRC1 관련 유전자 돌연변이체 및 MADS-box 유전자 돌연변이체에서 각각의 유전자들의 RNA 발현 양상을 분석하였다. PRC1 관련 유전자들의 발현은 야생형 (Col-0) 애기장대에서 온도에 의해 영향을 받았지만, 각 온도별 서로 다른 발달 시기에 의해서는 영향을 받지 않았다. MADS-box 관련 돌연변이체에서는 PRC1 관련 유전자 중 일부 (AtBMI1A, AtBMI1B, AtBMI1C)의 발현 양상이 변하였다. 따라서, 일부 PRC1 관련 유전자는 대기온도 감지 경로의 MADS-box 유전자들 (SVP, FLM, FLC)에 의해 전사 수준에서 조절될 가능성을 보여준다.
두번째로, 여러 PRC1 관련 단백질과 MADS-box 단백질간의 상호작용 분석을 위해 yeast two-hybrid assay를 수행하였다. 그 결과, SVP-AtBMI1A, FLMβ-AtBMI1A/B, FLMβ-AtJMJ14, FLC-AtBMI1A의 단백질-단백질 상호작용을 확인할 수 있었다. 이 결합을 in vitro pull down assay로 확인하기 위하여 대장균에서 Histidine (His) 및 Glutathione S-transferase (GST) tag을 가진 단백질들을 발현시켰다. 그 결과, LHP1/TFL2, AtBMI1B/C, AtRING1A/B는 단백질 발현이 약하거나 확인되지 않았으며, 일부 단백질은 western blotting assay에서도 예측되는 크기에서 발현되지 않았다. 그러나, AtBMI1A-His와 positive control로 사용하기 위한 FLMβ-His 단백질은 발현이 강하고 western blotting assay에서도 강한 강도의 band를 확인하였다. 따라서, 향후 연구에서 더 다양한 조건에서 단백질 발현 여부를 조사할 계획이다.
마지막으로 PRC1 관련 유전자와 MADS-box 유전자간의 유전학적 분석을 위해 svp-32, flm-3, flc-3 단일 돌연변이체와 lhp1-6/tfl2 단일 돌연변이체를 교배한 후에 각각의 단일 돌연변이체 및 이중 돌연변이체의 개화시기 표현형 분석을 위해 23℃와 16℃ 배양실에서 배양 중에 있다.
본 연구를 통해 대기온도 감지경로에서 중요한 전사조절인자로 작용하는 MADS-box 단백질이 온도 반응 개화시기를 조절하기 위해서 후성유전학 조절을 하는 PRC1 관련 단백질을 recruit할 갈 가능성을 제안하며, 후속 연구를 통해 이러한 가설을 입증할 필요가 있음을 제시 한다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 7
• 1. 식물 재료 및 생육 조건 7
• 2. 개화 시기 측정 7
• 3. Total RNA 추출 8
• 4. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 9
• 5. Genomic DNA 추출 10
• 6. Cloning 및 Transformation 10
• 7. Yeast two-hybrid analysis 11
• 8. 단백질 발현 조건 조사 12
• 9. 웨스턴 블롯 (Western blotting) 13
• Ⅲ. 결과 21
• 1. PRC1, AtJMJ14 및 MADS-box 관련 유전자들의 RNA 발현 분석 21
• (1) 야생형 (Col-0) 애기장대에서 PRC1 관련 유전자 및 AtJMJ14의 RNA 발현 분석 23
• (2) MADS-box 유전자의 돌연변이체에서 PRC1 관련 유전자 및 AtJMJ14의 RNA 발현 분석 29
• 2. PRC1 관련 단백질과 MADS-box 단백질간의 상호작용 분석 36
• 3. 단백질 발현 실험 42
• 4. PRC1 유전자 단일 돌연변이체 및 이중 돌연변이체의 개화 시기 분석 50
• (1) LHP1/TFL2 돌연변이체의 다른 온도에서의 개화시기 분석 50
• (2) LHP1/TFL2 돌연변이체와 MADS-box 유전자 SVP, FLM, FLC 돌연변이체간의 이중 돌연변이체의
• 다른 온도에서의 개화시기 분석 53
• Ⅳ. 고찰 57
• Ⅴ. 요약 59
• Ⅵ. 참고문헌 62