(The) anti-epidermoid cancer effect of eugenol : targeting OR7A17 induced cell cycle arrest and apoptosis|RISS 상세보기

국문 초록 (Abstract)

OR7A17 길항제 유제놀이 MAPK 신호 경로 억제를 통해 A-431 표피양 암종 세포의 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도함

배경
후각 수용체(Olfactory Receptors, ORs)는 원래 후각 기관에 국한된 것으로 알려져 있었으나, 최근 피부를 포함한 비-후각 조직에서도 이소성으로 발현되어 세포 증식, 사멸 등 생리적 과정에 관여함이 밝혀지고 있습니다. 특히, OR7A17은 각질세포 생물학 및 표피양 암종(Epidermoid Carcinoma)과 관련되어 새로운 치료 표적으로 주목받고 있습니다. 본 연구는 OR7A17의 리간드를 발굴하고, 이를 통해 표피암 치료에 대한 잠재적 응용 가능성을 탐색하고자 하였습니다.

연구 방법
유제놀의 OR7A17 길항 작용 및 항암 효능을 규명하기 위해 분자 도킹 및 AMDock 분석, Fluo-4 Ca²⁺ 유입 분석, CETSA(Cellular Thermal Shift Assay)를 통해 OR7A17과의 결합을 검증했습니다. 세포 생존력 및 증식은 CellTiter-Glo, EdU 통합 분석, Colony Formation 분석으로 평가했습니다. 세포 이동 능력은 Cell Scratch 분석으로 확인했습니다. 유제놀의 분자 기전은 Western Blot 분석을 통해 MAPK 경로(p38, ERK, JNK)의 인산화 변화 및 세포 사멸 관련 단백질(Bax, Bcl-2) 수준을 확인했으며, OR7A17 발현은 RT-PCR 및 Western Blot을 통해 비교 분석했습니다.

연구 결과
1. OR7A17 길항 작용 확립: 가상 스크리닝 결과, 정향유 유래의 천연 페놀 화합물인 유제놀(Eugenol)이 OR7A17 수용체 결합 부위에 높은 친화도(-5.7 kcal/mol)로 결합함을 보였습니다. CETSA 분석을 통해 유제놀과 OR7A17의 직접적인 결합이 확인되었으며, 유제놀은 OR7A17 과발현 HaCaT 세포에서 세포 내 Ca²⁺ 유입과 세포 증식을 현저히 억제했습니다. 또한, 유제놀은 MAPK 구성 요소(p38, ERK, JNK)의 인산화를 억제함으로써 OR7A17 매개 증식을 감소시켰으며, OR7A17 유전자 녹다운 시 이러한 효과가 약화되어 유제놀이 OR7A17의 길항 리간드로 작용함을 입증했습니다.
2. A-431 암세포에서의 치료 효과: 표피암 세포주인 A-431 세포는 정상 각질세포인 HaCaT 세포보다 OR7A17을 더 높게 발현하는 것으로 확인되었습니다. 유제놀은 HaCaT 세포에 비해 A-431 세포에서 세포 증식(Cell TiterGlo, EdU, Colony Formation) 및 세포 이동(Cell Scratch)을 더 강력하게 억제했습니다. 이는 A-431 세포의 높은 OR7A17 발현이 유제놀에 대한 민감도를 증가시킨다는 것을 시사합니다. 나아가, 유제놀 처리는 pro-apoptotic 단백질인 Bax의 증가와 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 감소를 유도함으로써 A-431 세포에서 세포 사멸(Apoptosis)을 유도했습니다.

결론
본 연구는 유제놀이 OR7A17의 효과적인 길항제이며, 그 항표피암 효과가 OR7A17 길항 작용을 통해 매개됨을 증명했습니다. 이러한 발견은 OR7A17이 피부암 치료제 개발을 위한 새로운 분자 표적임을 강력하게 시사합니다.

주제어
후각 수용체(OR), 유제놀(Eugenol), A-431, MAPK 신호전달, 세포 사멸

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OR7A17 길항제 유제놀이 MAPK 신호 경로 억제를 통해 A-431 표피양 암종 세포의 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도함 배경 후각 수용체(Olfactory Receptors, ORs)는 원래 후각 기관에 국한된 것으로 ...

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The anti-epidermoid cancer effect of Eugenol: Targeting OR7A17 induced cell cycle arrest and apoptosis

Background: Olfactory Receptors (ORs) are increasingly recognized to be ectopically expression in non-olfactory tissues, including the skin, where they are implicated in various cellular events. Since OR7A17, known to be involved in keratinocyte biology, is an orphan receptor, the purpose of this study was to identify OR7A17 ligands and investigate their potential application in the treatment of epidermal cancer.

Methods: To investigate the OR7A17 antagonism and anticancer activity of eugenol, various tools were introduced, including virtual screening and AMDock analysis, fluo-4 Ca²⁺ influx assay, and CETSA (cellular thermal shift assay), CellTiter-Glo, EdU incorporation, colony formation, and cell scratch assay. Western blot analysis and real-time PCR analysis were performed to elucidate the molecular mechanism of eugenol.

Results: The virtual screening showed that eugenol, a natural phenolic compound derived from clove oil, occupies the binding pocket of OR7A17 receptor with a high affinity (-5.7 kcal/mol). The direct binding between eugenol and OR7A17 was verified by CETSA, demonstrating eugenol as a ligand of OR7A17 receptor. In addition, eugenol significantly suppressed intracellular Ca²⁺ influx and cell proliferation in OR7A17-overexpressing HaCaT cells. Western blot also showed that eugenol reduces OR7A17-mediated proliferation by suppressing the phosphorylation of MAPK components. Furthermore, the eugenol effects were attenuated by the knockdown of OR7A17 gene. These results indicate that eugenol acts as an antagonistic ligand of OR7A17. In an experiment comparing the expression levels of OR7A17 in A-431 cells, an epidermal cancer cell line, and HaCaT cells, a normal keratinocyte cell line, A-431 cells were found to express more OR7A17 than HaCaT cells. In addition, eugenol inhibited cell proliferation and cell migration more potently in A-431 than in HaCaT. These results suggest that A-431 cells are more sensitive to eugenol than HaCaT cells because of higher expression of OR7A17 in A-431 cells. Furthermore, treatment with eugenol induced apoptosis in A-431 cells, as evidenced by an increase in the pro-apoptotic protein Bax and a decrease in the anti-apoptotic protein Bcl-2.

Conclusion: This study demonstrates eugenol as an OR7A17 antagonist and its anti-epidermoid cancer effect is mediated by OR7A17 antagonism. These findings also suggest OR7A17 as a novel molecular target for the development of skin cancer therapeutics.

Keywords: Olfactory Receptor, Eugenol, A-431, MAPK pathway, Apoptosis

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목차 (Table of Contents)

1. Introduction 1
2. Materials and Methods 5
2.1 Cell culture and Materials 5
2.2 Virtual Screening Analysis 5
2.3 Cell Viability Assay 6

1. Introduction 1
2. Materials and Methods 5
2.1 Cell culture and Materials 5
2.2 Virtual Screening Analysis 5
2.3 Cell Viability Assay 6
2.4 CellTiter-Glo 2.0 Assay for Proliferation Analysis 6
2.5 Fluo-4 Ca2+ Influx Assay 7
2.6 Western Blotting Analysis 7
2.7 EdU Incorporation Assay 8
2.8 Clonogenic Assay 9
2.9 Cell Scratch Assay 10
2.10 Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) 10
2.11 Statistical Analysis 11
3. Results 13
3.1 Eugenol is Identified as a Functional Antagonist of OR7A17 that Inhibits Receptor Activation 13
3.2 Eugenol Suppresses OR7A17-Mediated Keratinocyte Proliferation via Inhibition of MAPK Pathway Activation 17
3.3. OR7A17 Knockdown Attenuates OR7A17-Mediated Cell Proliferation and Eugenol-Induced Suppression of Receptor Activation 20
3.4 Eugenol Reduces Proliferation and Cell Migration in A-431 Epidermoid Carcinoma Cells 23
3.5 Eugenol Induces Apoptosis in A-431 Epidermoid Carcinoma Cells in a Dose-Dependent Manner 28
4. Discussion 30
5. References 34