인플루엔자 바이러스 HA 단백질에 의한 막융합과정을 억제하는 화합물의 발굴 = Chemical library screening for compounds that inhibit influenza virus hemagglutinin(HA)-mediated membrane fusion

국문 초록 (Abstract)

I. 연구개발의 목적 및 필요성
(1) 연구개발의 목적: 인플루엔자 바이러스의 세포내 침입을 매개하는 HA 단백질에 의한 막융합과정을 선택적으로 저해하는 화합물을 발굴함으로써，인플루엔자 바이러스 치료제로 개발될 수 있는 후보 물질의 발굴을 목표로 함.
(2) 연구개발의 필요성: 인플루엔자 바이러스에 의한 독감은 매년 전 세계 인구의 5 20%에서 발병이 되고，전 세계적으로 25만 50만명의 생명을 앗아갈 만큼 현 인류의 생존을 위협하는 질병 중 하나임. 유전적 변이(antigenic drift and antigenic shift)가 심한 인플루엔자 바이러스의 특성으로 인하여 계절 성 독감에 대한 백신과 항바이러스제의 수요는 매년 발생하는 상황임. 특히，2009년 대유행 (pandemic)했던 신종 인플루엔자 바이러스(swine-origin H1N1)와 같은 신종 바이러스의 출현 시 백 신의 개발이 최소 3 6개월 소요되기 때문에, 다양한 종류의 항바이러스제가 절실한 상황임. 현재 인플 루엔자 바이러스 치료제로 타미플루，리렌자 등의 neuraminidase inhibit가 사용되고 있으나，이미 내성을 보이는 인플루엔자 바이러스가 출현한 상황임. 따라서 특정 타겟단백질을 저해하는 항바이러스 제에 내성을 보이는 인플루엔자 바이러스에 대한 효과적인 치료를 위해 타겟단백질의 다양화가 절실한 상황임. 특히 인플루엔자 세포부착 및 세포침입에 필수적인 HA단백질을 타깃으로한 치료제 개발이 절 실히 요구되어짐.
II . 연구개발의 내용 및 범위
(1) HA 단백질에 의한 생체막융합을 측정할 수 있는 스크리닝 시스템의 구축
- 인플루엔자 HA단백질과 리포터 단백질(luciferase)을 지속적으로 발현하는 세포주의 확립
- HA단백질에 의한 세포막융합을 측정할 수 있는 세포기반 생체막융합측정 시스템의 확립
- Venus-N과 Venus-C가 서로 근접하여 Venus 형광단백질이 재구성되어 형성되고，이 Venus 단백 질의 형광을 정량함으로써 두 세포주간의 막융합을 측정할 수 있음.
(2) 표지화합물(triazine-tagged compound) 라이브러리 스크리닝을 통해 HA 단백질에 의한 생체막융 합을 저해하는 화합물 선발
- 확립한 세포기반 생체막융합 측정시스템을 활용하여 표지화합물 라이브러리를 대상으로 HA단백질 에 의한 생체막융합을 저해하는 화합물을 선발함.
III. 연구개발결과
(1) HA 단백질에 의한 생체막융합을 측정할 수 있는 스크리닝 시스템의 구축
- 다양한 type의 HA단백질에 의한 생체막융합을 luciferase assay를 이용하여 간단하게 측정할 수 있 는 측정시스템을 구축하였고 HTS용으로 최적화하였음.
⑵ 표지화합물(triazine-tagged compound) 라이브러리 스크리닝을 통해 HA 단백질에 의한 생체막융 합을 저해하는 화합물 선발
- HA에 의한 생체막융합을 저해 또는 억제하는 20여종의 신규 화합물을 선별하였음.
IV. 연구개발결과의 활용계획
- 본연구에서 확립한 세포기반 HA매개 생체막융합 측정법은 다양한 물질들(저분자 화합물，펩타이드， 압타머 등)로부터 억제제 또는 활성제를 스크리닝하는데 이용될 수 있을 것임.
- 본연구에서 선별한 HA매개 생체막융합 억제 화합물은 향후 분석 및 검증을 거친 후，인플루엔자 바이러스 치료제 후보물질로 개발될 수 있을 것임.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The ultimate aim of this research is to discover anti-influenza drug candidates by screening chemical compounds that selectively block membrane fusion mediated by hemagglutin(HA), an essential protein for viral entry. Influenza virus infects 5—20% of human population, and annually Mis 250,000 500,000 people all over the world, being one of the most deadly viruses. Influenza virus, partly because of its RNA genome, is characterized for its high mutation rate, and thus there is constant demand for anti-influenza vaccine and therapeutics. In particular, upon outbreak of novel strains, such as the swine-origin H1N1 strain that causes pandemic in 2009, development of vaccine against them takes at least 3—6 months, and thus various types of anti-influenza therapeutics are required. Therefore, for effective clearance of viruses from infected individuals, various influenza viral proteins should be considered as therapeutic targets. In this research project, we attempt to assess HA as a therapeutic target. To isolate chemical compounds that inhibit HA-mediate membrane fusion, we first established an assay that measures HA-mediate membrane fusion by take advantage of luciferase PCA (protein fragments complementation assay). Once the assay was established, we performed high-throughput screening for chemical compounds inhibiting HA-mediated cell-cell fusion. As a result, we identified over 20 chemical compounds that reliably block HA-mediate membrane fusion. The HA-mediated cell-cell fusion assay developed through this research project w川 provide a useful tool for screen inhibitors or stimulators that regulate HA-mediated membrane fusion from a variety of libraries including small-molecule compounds, peptides, and aptamers. In addition, the fusion inhibitors discovered from this research project will be useful for development of drug candidates for anti-influenza virus.