재조합의약품 N-당사슬 분석법 설정 및 평가지침 연구 = Studies on the establishment of methods and guidance for analysis of N-glycan in recombinant protein products

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Glycoprotein products are over 60% of protein products in the world market. Recently, the emerging market is the recombinant monoclonal antibody products and they are also glycoprotein products. Glycans in glycoproteins play important roles in the activity, pharmacokinetics, and immunogenecity. Although the same cell line is used for manufacturing the glycoprotein products, the glycoforms can be changed easily according to the manufacturing conditions such as cell culture parameters, production scale, and purificatino parameters. In this study, we performed the collaboratory study to prepare the reproducible and standardized SOPs for N-glycan analysis. Also, we prepared the guidelines for "characterization and specification of N-glycan in the glycoprotein products" and "comparability evaluation according to the change of manufacturing process in biological products". N-glycan analysis is performed by glycan struture analysis, monosaccharide composition, and sialic acid content. We established the deglycosylation procedures for each analysis. In the glycan structure analysis, N-glycans can be deglycosylated by an enzyme, PNGase F, or hydrazinolysis. In the protocol with PNGase F, the deglycosylation was efficient when the denaturing buffers are 1.5% SDS, 10% 2-mercaptoethanol or 1% SDS, 3.19% 2-mercaptoethanol, 3.7% EDTA, when N-glycan was purified by PGC(porous graphitized carbon) column or ethanol. In the protocol with hydrazine, the deglycosylation was efficient when the re-N-acetylation buffer was sodium bicarbonate after acid hydrolysis for 5 hours at 95℃. In the protocol of monosacchardie composition with PMP(1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone) labeling, the acid hydrolysis was efficient when samples were treated with 2N TFA for 4~5 hours at 100℃. The method had linearity in the range of 10~125 ug of monoclonal antibody product and 5~15 ug of erythropoietin product. The method had 16% RSD of precision and 80~120% recovery of accuracy because there are complex sample pretreatment steps including chloroform washing. In the protocol of sialic acid content, the acid hydrolysis was efficient when samples were treated with 0.1N HCl for 1 hours at 80℃. The method had linearity in the range of 50~150 ug of monoclonal antibody product and 5~15 ug of erythropoietin product. The method had 0.6~0.9% RSD of precision and 96~107% recovery of accuracy.

국문 초록 (Abstract)

전세계 단백질의약품 시장의 60% 이상이 당단백질의약품이며 최근 각광받고 있는 항체의약품 역시 당단백질의약품이다. 당단백질의약품의 당사슬은 활성, 체내 동태, 면역원성 등에 영향을 미치는 중요한 요소이며, 생산시 사용되는 숙주세포의 종류에 따라 다양한 당사슬 구조가 발현된다. 또한, 동일한 생산세포주를 사용한다 하더라도 배양조건, 생산규모, 정제조건 등의 생산조건에 따라 당사슬 발현 양상이 쉽게 변할 수 있으므로, 당단백질의약품에 대한 철저한 품질관리로 일관된 당사슬 양상이 발현되도록 하여 최종 제품에 영향이 없도록 하여야 한다. 그러나, 당사슬 구조의 복잡성 때문에 분석법별로 매우 다양한 특수한 기술을 사용하여야 하고, 극미량 시료 사용 등으로 인해 재현성을 얻기에 어려움이 있다. 이에 재현성 있고 표준화된 N-당사슬 분석법을 설정하기 위하여 현재 시판되고 있는 당단백질의약품을 이용한 공동연구를 수행하였고, 당단백질의약품의 당구조 분석 관련 가이드라인과 제조방법 변경에 따른 비교동등성 평가 가이드라인을 발간하였다. N-당사슬 분석은 크게 당사슬 구조분석, 단당류 조성분석, 시알산 함량분석으로 구분할 수 있다. 당사슬 구조분석은 효소 혹은 하이드라진을 이용한 탈당화 과정 후에 액체크로마토그래피나 질량분석기분석을 통하여 이루어진다. 본 연구에서는 탈당화 과정의 세부조건을 선별검사하여 최적의 조건을 설정하였다. 효소를 이용한 탈당화 시험법은 당단백질의약품을 1.5% SDS, 10% 2-mercaptoethanol 혹은 1% SDS, 3.19% 2-mercaptoethanol, 3.7% EDTA의 denaturing 버퍼 조건에서 PNGase F를 처리한 후 PGC(porous graphitized carbon) 컬럼 혹은 에탄올로 분리하였을 때 효율적이었다. 하이드라진을 이용한 탈당화 시험법은 95℃에서 5시간 동안 하이드라진을 처리한 후 sodium bicarbonate를 re-N-acetylation 버퍼로 사용하였을 때 효율적이었다. PMP(1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone) 표지를 이용하는 단당류 조성분석법은 100℃에서 2N TFA를 4～5시간 처리하였을 때 효율적이었으며, 항체의약품 10-125 ug과 에리스로포이에틴 5～15 ug에서 직선성을 보였다. 그러나 PMP 표지는 클로로포름 세척과정 등 복잡한 전처리 과정을 필요로 하므로 상대표준편차 16%의 정밀성과 80～120% 회수율의 정확성을 보였다. 시알산 함량분석은 80℃에서 0.1N 염산을 1시간 처리하였을 때 효율적이었으며, 항체의약품 50～150 ug과 에리스로포이에틴 5～15 ug에서 직선성을 보였으며 상대표준편차 0.6-0.9%의 정밀성과 96～107% 회수율의 정확성을 보였다.확립된 4가지 탈당화 시험법에 대하여 국내 4곳의 연구기관에서 항체의약품 및 에리스로포이에틴을 사용하여 공동연구를 진행하였다. 효소를 이용한 탈당화 시험은 모든 연구기관의 결과가 유사하였으나, 하이드라진을 이용한 탈당화 시험은 에리스로포이에틴의 결과에 차이가 있었다. 하이드라진은 시알산이 많은 당단백질에 대해 민감한 것으로 보인다. PMP 표지를 이용한 단당류 조성분석 시험은 33-53%의 상대표준편차를 보였는데, 클로로포름 세척 등 전처리 과정에 의해 실험실 간 편차가 발생하는 것으로 판단된다. 시알산 함량분석은 에리스로포이에틴에서 8.76%의 상대표준편차를 보였으나 시알산 함량이 적은 항체의약품에서는 약 60%의 편차를 보였다.