인간 대장암 세포주 모델에서의 신규 도파민 수용체 D2 길항제의 세포사멸 유도 기전 연구 = Study on the cell death-inducing mechanism of novel dopamine receptor D2 antagonists in human colorectal cancer cell model

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Colorectal cancer (CRC) is one of the most prevalent malignancies worldwide, with a steadily increasing incidence. Despite advances in therapeutic strategies, early detection remains challenging, and the frequent development of resistance to anticancer therapies represents a major obstacle to effective treatment. In particular, resistance to epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors, which are widely used as standard therapies for CRC, has emerged as a significant clinical problem due to limited and variable therapeutic responses.
Accumulating evidence suggests that G protein–coupled receptors (GPCRs) play critical roles in the regulation of tumor growth, survival, and progression. Among them, dopamine receptor D2 (DRD2), a member of the GPCR family, has been implicated in the regulation of cell proliferation, differentiation, and apoptosis in various cancer types. Dopamine is abundantly distributed throughout the human body, with relatively high concentrations reported in the gastrointestinal tract, suggesting that DRD2-mediated signaling may influence CRC biology and tumor behavior.
In this study, we investigated the anticancer effects and underlying molecular mechanisms of newly synthesized DRD2 antagonists, SD2-2305 and SD2-2310, using human CRC cell lines HCT116 and HT-29. Treatment with SD2-2305 and SD2-2310 significantly reduced cell viability in a dose-dependent manner in both cell lines. Immunoblot analysis of apoptosis-related proteins, including caspase cascade components and Bcl-2 family members, revealed cell line–specific apoptotic responses. In HCT116 cells, increased levels of cleaved caspase-3 and caspase-7 were evident, whereas no such changes were observed in HT-29 cells. Conversely, expression of Bcl-2 family proteins remained unchanged in HCT116 cells, while an increase in the pro-apoptotic protein Bak was detected in HT-29 cells.
Further analysis demonstrated that treatment with SD2-2305 and SD2-2310 markedly reduced the expression of key cell cycle regulators, including CDK1, CDK2, Cyclin A, and Cyclin B, suggesting suppression of cell cycle progression. Examination of major survival signaling pathways revealed decreased phosphorylation of p38 MAPK in both cell lines. In contrast, phosphorylation of the downstream effector p70S6K within the AKT/mTOR signaling pathway was increased, while no significant changes were observed in the JAK/STAT pathway.
Collectively, these findings demonstrate that the newly synthesized DRD2 antagonists SD2-2305 and SD2-2310 induce apoptosis or suppress cell growth in CRC models through modulation of cell cycle regulators and survival signaling pathways. This study provides experimental evidence supporting DRD2 antagonism as a potential novel therapeutic strategy for CRC and underscores the need for further investigation of DRD2 antagonists as promising anticancer candidates.

국문 초록 (Abstract)

대장암은 전 세계적으로 높은 발병률을 보이는 악성종양 중 하나로, 발생 빈도가 꾸준히 증가하고 있다. 이 질환은 조기에 발견되기 어려우며, 항암제 내성이 빈번하게 발생하여 치료에 큰 어려움이 있다. 특히 대장암의 표준 치료 중 하나로 사용되고 있는 상피세포 성장인자 수용체(Epidermal growth factor receptor, EGFR) 억제제에 대한 내성과 제한적 치료 반응이 중요한 임상적 문제로 지적되고 있다.
이미 많은 선행 연구를 통해 다양한 G 단백질 연결 수용체(G protein–coupled receptor, GPCR)들이 종양의 성장, 생존 및 진행 조절에 관여한다는 사실이 보고된 바 있으며, 최근 연구들에서 GPCR의 일종인 도파민 수용체 D2(Dopamine receptor D2, DRD2)가 다양한 암종에서 세포 증식, 분화 및 세포사멸(apoptosis) 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려지고 있다. 인간의 다양한 장기에서는 널리 도파민이 분포되어 있으며, 이 중 장에는 비교적 높은 수준의 도파민이 존재하는 것으로 보고되었다. 이러한 장의 도파민 환경은 장에 발생한 대장암 세포에 DRD2 매개 신호전달의 활성화와 종양 생리 조절에 영향을 줄 가능성이 매우 높다.
본 연구에서는 인간 대장암 세포주인 HCT116과 HT-29를 연구모델로 하여 신규 합성한 DRD2 길항제 SD2-2305와 SD2-2310의 항암 활성과 세포사멸 유도 기전을 규명하고자 하였다. 연구모델로 사용한 두 세포주에 SD2-2305와 SD2-2310 처리한 결과, 두 세포주 모두에서 농도 의존적으로 세포 생존율이 유의하게 감소하였다. immunoblot 분석을 통해 caspase cascade 및 Bcl-2 family 단백질 등 세포사멸과 관련된 단백질의 발현을 확인한 결과, 두 세포주 모두 신규 화합물에 의해 세포 생존율이 감소하였지만 각기 다른 단백질 발현 변화가 관찰되었다. SD2-2305는 HCT116 세포주에서 cleaved caspase-3 및 cleaved caspase-7의 증가가 관찰되었으나, HT-29 세포주에서는 확인되지 않았으며, HCT116 세포주에서는 Bcl-2 family 단백질의 발현 변화가 없었으나, HT-29 세포주에서는 Bak의 단백질 발현이 증가하였다.
SD2-2305와 SD2-2310에 의한 세포사멸 기전을 연구하기 위하여 세포주기 조절인자인 CDK/Cyclin 단백질 발현을 확인한 결과, 두 세포주에서 공통적으로 CDK1, CDK2, Cyclin A, Cyclin B의 발현이 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 대표적인 세포 증식 및 생존 조절 신호전달 경로인 MAPK 신호전달 단백질들에 미치는 영향을 확인한 결과, 두 화합물 모두 두 세포주에서 p38의 인산화 정도를 감소시켰으며, 또 다른 세포 생존 및 항세포사멸 신호전달 경로인 AKT/mTOR 신호전달 경로에서는 하위 신호전달 단백질인 p70S6의 인산화 증가가 확인되었다. 그리고, 세포 생존 신호전달 경로인 JAK/STAT 신호전달 경로에는 특별한 변화가 없었다.
본 연구에서는 신규 합성 DRD2 길항제인 SD2-2305와 SD2-2310이 대장암 세포주 모델에서 세포사멸을 유도하거나 세포의 성장을 억제하였으며, 이러한 현상은 SD2-2305와 SD2-2310이 세포주기 조절과 관련된 주요 Cyclin/CDK 단백질 발현 변화와 생존 신호전달 경로의 조절을 동반하여 나타난 것으로 확인하였다. 본 연구 결과는 DRD2 길항을 통한 대장암 치료가 새로운 항암 전략이 될 수 있음을 시사하는 실험적 증거로 앞으로 추가적인 연구를 통해 항암 후보물질로서 DRD2 길항제에 대한 연구 수행의 필요성을 보여준다.

목차 (Table of Contents)

• (Abstract)
• I. 서론 1
• 1. 대장암 1
• 1.1. 대장암의 개요 1
• 1.2. 대장암 주요 신호전달 경로와 돌연변이 1
• 1.3. 대장암의 기존 치료 전략 및 바이오마커 3
• 1.4. 기존 치료의 한계 및 GPCR 기반 신호전달의 중요성 4
• 1.5. 대장에서의 도파민 생성 4
• 2. 암에서 중요한 수용체 기반 신호전달 6
• 2.1. 수용체 티로신 인산화효소(RTKs) 7
• 2.2. 암에서의 G단백질 연결 수용체(GPCRs) 8
• 2.2.1. RTK와 GPCR의 cross-talk 8
• 2.2.2. 신경전달물질·호르몬 관련 GPCR 9
• 2.2.3. Wnt–Frizzled signaling GPCR 9
• 3. 도파민 수용체 D2(Dopamine receptor D2, DRD2) 10
• 3.1. 도파민 및 도파민 수용체의 개요 10
• 3.1.1. D1형 수용체(D1-like receptors) 10
• 3.1.2. D2형 수용체(D2-like receptors) 11
• 3.1.3. DRD2 매개 신호전달(Dopamine receptor D2-mediated signaling) 11
• 4. 연구 필요성 및 목적 12
• 4.1. 연구 필요성 12
• 4.2. 연구 목적 13
• Ⅱ. 재료 및 방법 14
• 1. 세포주 및 시약 14
• 1.1. HCT116 14
• 1.2. HT-29 14
• 1.3. 신규 DRD2 길항제 15
• 2. 세포 생존율 분석 18
• 3. Immunoblot 분석 18
• 4. 통계 분석 20
• Ⅲ. 결과 21
• 1. SD2-2305 및 SD2-2310 처리 후 세포 생존율 변화 21
• 2. SD2-2305 및 SD2-2310 처리에 따른 apoptosis 관련 신호 변화 25
• 3. SD2-2305 및 SD2-2310 처리에 따른 세포주기 조절 단백질 발현 변화 27
• 4. SD2-2305 및 SD2-2310 처리에 의한 AKT/mTOR 경로 조절 29
• 5. SD2-2305 및 SD2-2310 처리에 따른 MAPK 신호 단백질의 인산화 변화 31
• 6. SD2-2305 및 SD2-2310 처리에 따른 JAK/STAT 경로의 보조적 분석 및 변화 평가 33
• 7. SD2-2305 및 SD2-2310 처리에 따른 도파민 수용체(DRD1–DRD5) 발현 분석 35
• Ⅳ. 고찰 37
• Ⅴ. 결론 41
• Ⅵ. 참고문헌 42