인터페론 활성화와 RNA 간섭현상이 동시에 유도되는 5'-triphosphate-siRNA 에 의한 콕사키바이러스성 심근염 완화 기전 규명 = Attenuation of coxsackieviral myocarditis by 5'-triphosphate-siRNA inducing both RIG-I dependent interferon activaion and RNA interference

국문 초록 (Abstract)

Ⅰ. 연구개발의 목적및 필요성
■ siRNA 의 5' 말단에 triphosphate를 포함하고 있는 콕사키바이러스 B3 (CVB3) 특이적 small interfering RNA (3p-siRNA) 에 의한 항바이러스성 유도를 CVB3 에 의한 심근염 모델에서 검증하고자 함.
■ 3p-siRNA 에 의해 유도되는 RIG-I 의존적 인터페론 활성화와 RNA 간섭현상에 대한 메카니즘을 심근염 모델에서 규명함.
Ⅱ. 연구개발의 내용및 결과
1) 5'-triphosphate siRNAs (3p-siRNAs)와 5􌃖-hydroxyl siRNAs (OH-siRNAs)형태의 siRNA를 viral 유전자의 2C, 3C, 3D region을 target 으로 제작하였음.
2) 세포 수준에서 3p-siRNA 항바이러스 효과를 OH-siRNAs 와 비교하여 분석하기 위해 세포병변 효과와 바이러스 생산을 측정한 결과 OH-#5 siRNA 는 OH-Cont 에 비해 세포병변 효과 및 바이러스 생산이 저해됨을 확인하였고, 마찬가지로 3p-Cont siRNA 도 역시 OH-Cont 에 비해 세포병변 효과 및 바이러스 생산이 저해됨을 확인하였음. 특히, RNAi 현상과 innate immunity 현상이 동시에 유도되도록 제작된 3p-#5 siRNA 는 가장 좋은 효과로 세포 병변 효과 억제 및 바이러스 생산 저해가 유도됨을 확인하였음.
3) 3p-siRNAs 에 의한 선천면역 시스템 활성화의 작용 메카니즘을 세포수준에서 분석하기 위해 real time PCR 을 통하여 인터페론 알파 베타, 또는 각종 사이토카인의 RNA 수준을 측정한 결과 3p-Cont, 3p-#5 siRNA 는 Mock 와 OH-siRNA 에 비해 100배 이상의 상당한 인터페론 베타와OAS expression을 증가시킴을 확인하였음.
4) 3p-siRNA 의 RNAi 현상의 작용 메카니즘을 세포수준에서 분석 확인하기 위하여 5'RACE를 통해 viral genome cleavage 확인하였음.
5) CVB3 에 의한 심근염 동물 모델에서 5'-triphosphate siRNA 의 항바이러스 효과를 병리기작과 관련하여 규명하였고, 심장 세포에서 바이러스 증식 저해효과를 확인하였음. 또한 이러한 항바이러스 효과는 5􌃖-triphosphate siRNA 에 의한 innate immunity활성화에 의한 것임을 in vivo 에서 확인하였음.
Ⅲ. 연구개발결과의 활용계획
본 연구는 그간 이루어진 바이러스 게놈을 표적으로 하는 siRNA 의 항바이러스 제제 개발을 위한 분야에 좀더 획기적으로 접근 가능할 것임.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background : Coxsackievirus B group, in particular coxsackievirus B (CVB3) is the major pathogen associated with acute and chronic myocarditis. However, antiviral therapeutics for CVB3 has yet to be established. In this study, to develop noble therapeutic agent, we evaluated the anti-viral effects of 5??-triphosphate siRNA (3p-siRNA) against CVB3 through both RNA interference (RNAi) as well as activation of innate immunity.
Methods and Results : We synthesized 3p-antiviral siRNAs against the viral 2C, 3C, and 3D region. 3p-antiviral siRNAs (3p-#1, 3p-#5, and 3p-#9) exhibited significant protective cytopathic effects by inhibition of CVB3 virus production in vitro compared to 3p-siRNA (3p-Control ; 3p-C) and conventional siRNAs (OH-siRNAs). In mice infected with CVB3, 3p-siRNAs (3p-#5, 3p-C) more effectively led to recovery of weight loss, a significant decrease of myocardial inflammation, and reduction of virus replication than that of OH-siRNAs. In particular, the 3p-antiviral siRNA (3p-#5) showed significantly greater anti-viral effects than the 3p-C siRNA. We confirmed that anti-viral effects of 3p-siRNAs were due to the activation of type I IFNs. In addition, we also confirmed that the anti-viral effects of 3p-antiviral siRNA are further enhanced by the sequence specific gene cleavage it induces.
Conclusions : These data clearly demonstrate that 3p-antiviral siRNA can significantly attenuate myocardial inflammation followed by CVB3 infection through the mechanism of both gene-silencing and immunostimulation. Additionally, our results suggest that 3p-antiviral siRNA has a potential role among future treatment options targeting other viral disease as well as coxsackieviral diseases.