항암제 내성기전에 대한 약물유전체 기능연구 = Pharmacogenomic study on anticancer drug resistance in colorectal cancer

국문 초록 (Abstract)

항암제에 대한 약물반응을 환자마다 다른 양상을 보인다. 이에 따라 항암제의 치료 효율을 높이기 위해 개인맞춤약물에 대한 연구가 대두되고 있다. 하지만 아직까지 약물반응에 차이를 보이는 원인 을 설명할 수 있는 유전학적/후성유전학적 인자 및 관련 기전에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 직장암 환자들의 혈액과 조직을 대상으로 하여 환자간 약물반응 차이를 보이는 원인을 분석하고자 하였다. 정상인 30명과 5-FU기반 항암화학요법을 받는 2-3기 직장암환자 30명의 peripheral blod에서 약물반 응 차이를 Ilumina Infinium HumanMethylation450 platform을 통해 DNA 메틸화에 의한 영향인지에 대해 분석을 실시하였다. 그 결과 약물반응군(grade0, 1)와 비약물반응군(grade2, 3) group은 확연히 서 로 다른 메틸화 패턴을 보였고, 242개의 DMRs (diferentialy methylated regions)을 선별하였다 (deltabeta> 0.1, p<0.05). 그 중 cg2092097, cg184029, cg19319317, cg09718037에서는 비약물반응군 보다 약물반응군에서 더 높은 메틸화를 보였고, cg20212912, cg0235809에서는 반대의 패턴을 나타냄을 확인하였다. 또, 선별된 242개 DMRs중에서 146개가 SNP에 집중되었는데(p=2.2e-16), 약물반응군과 비 약물반응군은 SNP에 의해 서로 다른 메틸화 패턴을 보이며 그에 따라 항암제에 대해 서로 다른 약물 반응을 보임을 알 수 있었다. 추가적으로 20개 DMRs 후보 유전자를 선정하고(deltabeta>0.15, p<0.01) genotyping 및 in-vitro 연구를 통해 검증하고자 하였다. Genotyping 분석 결과, rs26953 등 13개가 SNP에 의한 DNA 메틸화의 변화임을 확인하였다. 반면, SNP와 DNA 메틸화 패턴이 일치하지 않은 rs20320545(CAPN2), rs71470391, rs1417894(MAG), rs15142731(ESPNL;SCLY), rs143171723(CACNG3)를 대상으로 pyrosequencing 분석을 수행하였다. 그 중 CAPN2는 SNP와 DNA메틸화 패턴이 일치, MAG, ESPNL;SCLY, CACNG3는 불일치하였다. 이 결과를 바탕으로 SNP와 DNA 메틸화 패턴이 불일치하고 유전자가 TSS150에 위치한 ESPNL과 CACNG3를 최종 후보 내성 유전자로 선정하고 세포독성 및 내 성기전 분석을 실시하였다. 그 결과, CACNG3를 과발현 시켰을 경우 5-FU에 내성을 가진 DLD-1 세 포주에서는 5-FU에 더 내성을 가졌고 p38 MAPK 기전이 관여하였다. 5-FU에 민감한 LoVo 세포주에 서는 5-FU에 더 민감하였고 JNK 기전이 관여하였다. ESPNL을 저발현 시켰을 경우 DLD-1 세포주에 서는 5-FU에 민감하였고 이때 ERK 기전이 관여하는 것을 알 수 있었다. LoVo 세포주에서는 5-FU에 가장 민감하였고 ERK 기전이 관여함을 확인하였다. 그러나 최종적으로 해당 유전자의 ex-vivo 검증을 위해 ESPNL, CACNG3를 포함한 7개 유전자에 대해 RT-PCR와 면역염색을 시행한 결과, CAPN2, SCLY, MAG, TAS1R3의 정상 대장세포에서 보다 대장암세포에서 특이적으로 진하게 염색되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 ESPNL과 CACNG3는 암세포보다 암세포주변의 혈관내피세포 등 암연관섬유 아세포에 주로 분포하고 있어, 항암제 내성기전에 암미세환경의 영향이 상당히 연관되어 있음을 확인 할 수 있었다. RT-PCR결과에서도 약물반응군에서 CAPN2와 SCLY, MAG 유전자가 비약물반응군보다 각 각 1585배, 2571배, 1068배 많이 발현되었다. 이를 통해, 최종 후보내성유전자로 선정한 ESPNL과 CACNG3는 암 미세환경 연구의 중요한 기본자료가 될 것으로 판단된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The drug response to anticancer drugs varies from patient to patient. Therefore, studies on individualized drugs have ben started to improve the treatment eficiency of anticancer drugs. However, the genetic / epigenetic factors and asociated mechanisms that may explain the cause of diferences in drug responses are not wel known. The purpose of this study was to analyze the causes of drug reaction betwen patients with blod and tisues of colorectal cancer patients. We analyzed the efect of DNA methylation on the peripheral blod of 30 normal subjects and 30 peripheral cancer patients who received chemotherapy based on 5-FU on the Ilumina Infinium HumanMethylation 450 platform. As a result, DMRs (diferentialy methylated regions) were selected (deltabeta>±0.1, p <0.05), and the DMRs (grade 0, 1). Among them, cg2092097, cg184029, cg19319317, cg09718037 showed higher methylation in the responder group than in the non-responder group, and reversed paterns in cg20212912 and cg0235809. Of the 242 DMRs selected, 146 were concentrated in the SNP (p = 2.2e-16), and the responder group and the non responder group showed diferent methylation paterns depending on the SNPs. Aditional 20 candidate DMRs were selected (deltabeta>±0.15, p <0.01) for genotyping and in-vitro studies. Genotyping analysis revealed that 13 of rs26953, including DNA methylation, were changed by SNP. On the other hand, pyrosequencing analysis was performed on rs20320545 (CAPN2), rs71470391, rs1417894 (MAG), rs15142731 (ESPNL; SCLY) and rs143171723 (CACNG3), which do not match the SNP and DNA methylation paterns. Among them, CAPN2 and SNP were in agrement with DNA methylation patern, and MAG, ESPNL, SCLY and CACNG3 were inconsistent. Based on these results, ESPNL and CACNG3 genes with SNPs and DNA methylation paterns disagre and TSS150 genes were selected as the candidate endogenous genes, and cytotoxicity and resistance mechanism analysis were performed. As a result, when overexpresing CACNG3, 5-FU-resistant DLD-1 cel line was more resistant to 5-FU and p38 MAPK mechanism was involved. The 5-FU-sensitive LoVo cel line was more sensitive to 5-FU and involved the JNK mechanism. When ESPNL was expresed at low level, it was sensitive to 5-FU in DLD-1 cel line, and it was found that ERK mechanism was involved. In the LoVo cel line, 5-FU was the most sensitive and ERK mechanism was involved. However, RT-PCR and immunohistochemical staining for seven genes including ESPNL and CACNG3 for ex-vivo validation of the gene finaly revealed that the expresion of specific genes such as CAPN2, SCLY, MAG, TAS1R3 in colorectal cancer cels. As a result. ESPNL and CACNG3 are mainly distributed in cancer-asociated fibroblasts, such as vascular endothelial cels around cancer cels, indicating that the cancer microenvironment has a considerable influence on the anticancer drug resistance mechanism. In the RT-PCR results, CAPN2, SCLY and MAG genes were expresed 1585, 2571, and 1068 times more in the responder group than in the non-responder group, respectively. Through this, ESPNL and CACNG3 selected as the candidate resistance genes wil be important basic data of cancer microenvironment study.