배양된 중추신경세포에서 몇 가지 산화질소 생성 화합물에 의한 신경세포사멸 기전에 대한 연구 = (The) mechanisms of neuronal deaths induced by NO donor compounds in mouse cortical cultures

국문 초록 (Abstract)

중추신경계에서 과다한 산화질소(NO)의 생성은 다양한 실험 모형에서 신경세포사멸을 유도함이 알려져 있다. Sodium nitroprusside(SNP)와 5-noso-N-acetylpenicillamine(SNAP)은 각종 실험모형에서 가장 많이 사용되는 NO 공여제이다. 본 연구는 배양된 중추신경세포에서 이 두 약물에 의한 신경세포사멸에 대한 각종 약물의 억제작용을 비교함으로서 이 약물의 차이를 밝혀 NO 연구에 자주 사용되는 이 약물들의 사용에 새로운 지견을 제시하고자 하였다.
태령 15-17일 된 생쥐 대뇌 피질 신경세포를 미리 교세포가 배양된 배양접시에 13-14일 배양하여 사용하였으며 세포사멸은 약물처리 24 혹은 48시간 후에 배양접시의 배지내로 유출된 lactate dehyogenase(LDH)의 양을 측정하여 정량하였다.
두 약물 모두 용량의존적인 신경세포사멸작용을 나타냈으며, SNP가 훨씬 낮은 농도에서 신경세포사별작용을 유발하였다. 즉 24시간 처리로 SNAP 500 HM과 SNP 0.3 μM이 비슷한 정도(40-50%)의 신경세포사별을 유도하였다. 또한 SNAP는 노출시간을 48시간으로 연장함에 따라 신경세포사멸도 현저하게 증가하였으나, SNP의 경우에는 노출시간 연장이 신경세포사멸 작용을 크게 증강시키지 않았다.
본 실험에서는 500 μM SNAP과 1 μM SNP에 의한 신경세포사멸에 대한 각 종 약물의 작용을 조사하였다. 항산화제인 trolox, ascorbic acid 및 항산화 플라보노이드인 rutin 처리는 각각 두 약물에 의한 신경세포사별을 모두 유의하게 억제하였으며, SNAP보다도 SNP에 의한 신경세포사멸을 더욱 강력하게 억제하였다. 철 이온 chelator인 deferoxamine 처리는 SNP에 의한 신경세포사별을 완전히 억제하였으나 SNAP에 의한 신경세포사별은 억제하지 못하였다. NO의 작용점이 되는 guanylate cyclase의 선택적 억제제인 ODQ는 동시처리 시에는 효과가 없었으나 2시간 전에 처리하면 두 약물에 의한 신경세포사멸을 유의하게 억제하였다. 이 억제작용은 SNAP에 의한 신경세포사별에 대해서 더 강력하였다. 한편 단백합성 억제제인 cycloheximide도 동시 처리에 의해서는 두 약물에 의한 신경세포사멸을 억제하지 못하였으나 2시간 전 처리에 의해서는 두 약물에 의한 신경세포사멸을 유의하게 억제하였다. 고사성 신경세포사멸을 억제하는 약물인 ZVAD-FMK, BDNF 및 IGF-1 처리는 두 약물에 의한 신경세포사별에 영향을 미치지 못하였다. 세포막 칼슘이온통로 봉쇄제인 nifedipine 처리는 SNP에 의한 신경세포사멸은 강력하게 억제하였으나 SNAP에 의한 신경세포사멸에는 영향을 미치지 못하였다. 그러나 세포 내에서 칼슘이온을 chelation하는 BAPTA/AM 및 내형질막의 Ca^(+2)-ATPase를 억제하여 세포질 내 칼슘농도를 저하시키는 thapsigargin 처라는 두 가지 약물에 의한 신경세포사멸에 영향을 미치지 못하였다.
이상의 성적은 SNAP과 SNP에 의한 신경세포사멸과정에 공통적으로 산화적 손상과 더불어 NO 생성에 의한 guanylate cyclase의 활성화 및 새로운 단백합성이 관여함을 가리키고 있으며, SNP에 의한 신경세포사멸 과정에는 SNAP에 의한 신경세포사멸과정에서는 관찰할 수 없는 철 이온에 의한 산화적 손상, 세포 외액 칼슘이온의 세포질 내로의 이동이 관여함을 시사하고 있다. 즉 두 가지 NO 공여제로 사용되는 약물에 의한 신경세포사멸에 서로 다른 기전이 관여하고 있음을 시사하고 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

It is well known that nitric oxide (NO) induces neuronal death under some conditions. Sodium nitroprusside (SNP) and S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP) are frequently used as NO donors in many laboratory experiments. To delineate the differences of these two drugs in the mechanism of neurotoxicity, the effects of some neuroprotective drugs on the 1 μM SNP- or 500μM SNAP-induced neuronal death were examined in mouse cerebral cortical cell cultures. Cell death was assessed by measurement of lactate dehydrogenase efflux to bathing media at the end of 24 hr or 48 hr exposure.
SNP and SNAP induced concentration-dependent neuronal deaths, and SNP was much more potent than SNAP. The SNAP-induced neurotoxicity was markedly increased by extending the exposure time from 24 hr to 48 hr, while the exposure time prolongation had little effect on the SNP-induced one.
Treatments with antioxidants such as trolox, ascorbic acid or rutin markedly inhibited the neuronal death indcuced by SNP or SNAP, whereas SNP-induced neuronal death was more susceptible to the antioxidant treatment. Deferoxamine, an iron chelator, almost abolished the SNP-induced neuronal death but had no effect on the SNAP-induced one. Both of neuronal deaths were significantly attenuated by 2 hr pretreatment with ODQ, a guanylate cyclase inhibitor. Pretreaeent with cycloheximide, a protein synthesis inhibitor, also significantly inhibited both of neuronal deaths. However, treatments with the anti-apoptotic agents such as ZVAD-FMK, BDNF and IGF-1 had no effect on the neuronal deaths. Nifedipine, a calcium channel blocker, markedly attenuated the SNP-induced neuronal death, but had no effect on the SNAP induced one. Cytosolic calcium modulating agents such as BAPTA/AM and thapsigargin did not affect both of the neuronal deaths.
These findings demonstrate that oxidative stress, the activation of guanylate cyclase and new protein synthesis are commonly involved in the SNP- or SNAP-induced neuronal death, while iron-induced free radical generation and influx of calcium ion are involved in only SNP-induced neuronal death. These results suggest that SNP and SNAP induce neuronal death via some different mechanisms.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• (국문초록) = 1
• 서론 = 3
• 실험 방법 = 5
• 실험성적 = 8
• 고찰 = 28
• 결론 = 31
• 참고문헌 = 32
• (Abstract) = 36