Anti-obesity effects of kefir in adipocyte cell line and high-fat diet-induced obese mice

국문 초록 (Abstract)

최근 프로바이오틱스로서 주목을 받고 있는 케피어(kefir)는 유산균 Lactobacilli, Lactococci, Leuconostocs와 효모의 복합체인 케피어 그레인(kefir grain)을 우유에 넣어 발효시켜 만든 유산균 음료로 발효유의 보편적 형태인 요구르트보다 더 높은 영양적 가치가 보고되어 왔다. 그럼에도 케피어의 기능성에 관한 연구들은 면역증강 활성을 중심으로 보고되어 있을 뿐 대표적인 대사성 증후군의 하나인 항비만 효능에 대한 연구는 보고된 바 없다.
본 연구는 케피어의 항비만 효과를 in vitro 3T3-L1 전지방세포주(preadipocyte cell line)와 in vivo 고지방식이성 비만 마우스 모델을 사용하여 검토하였다. In vitro 실험에서 케피어 배양액을 배지, 수용성 상층액 및 불용성 고형분으로 각각 분리하여 3T3-L1 전지방세포의 독성도를 MTT assay, 성숙지방세포의 지방축적 억제활성을 Oil red O 염색, 성숙지방세포로의 분화 억제 활성을 GPDH assay를 통하여 각각 검토한 결과 불용성 고형분에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 케피어 배양액 분리물들의 항비만 mechanism을 영양유전체학(nutrigenomics)적으로 해석하기 위해 RT-PCR를 실시하였다. 성숙지방세포 내에서 지방세포생성(adipogenesis) 및 지방생합성(lipogenesis)에 관여하는 전사인자인 C/EBP β, C/EBP α, PPAR γ, aP2, SREBP-1c, FAS, ACC와 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)인 IL-6, TNF α의 유전자를 대상으로 발현을 검토하였다. 그 결과 케피어 배양액 분리물들은 상기 전사인자들 중 C/EBP α, PPAR γ, SREBP-1c, aP2, TNF α의 발현을 유의있게 억제함을 알 수 있었다.
상기 in vitro 실험에서 밝힌 케피어의 항비만 효능을 in vivo 동물실험에서 평가하고 항비만 mechanism을 영양유전체학적으로 규명하고자 하였다. 실험동물은 생후 4주령의 C57BL/6 마우스(n=32)를 사용하였으며 실험군은 난괴법(randomized complete block design)에 따라 정상식이군, 고지방식이군, 고지방식이에 급속동결 건조한 케피어 분말 0.1%(w/w)와 0.2%(w/w)를 첨가한 식이군으로 구분하였다. 총 4군을 8주간 사육 후, 체중 및 기타 비만 관련 바이오마커를 측정한 결과, 케피어를 첨가한 식이군은 고지방식이군과 비교하여 식이섭취량에 영향을 미치지 않으면서, 누적체중증가량 및 내장지방량은 케피어 급여량에 따라 농도 의존적으로 감소하였다. 혈청의 LDL cholesterol, triglyceride, total cholesterol은 고지방식이군에 비해 케피어 급여량에 따라 농도 의존적인 감소를, 혈청의 HDL cholesterol은 증가를 나타내었다. 특히 간에서의 AST, ALT와 triglyceride가 현저하게 감소함으로써 지방간 생성 억제 및 간보호 효과를 확인하였다. 케피어의 생화학적 항비만 효과를 유전자 수준에서 규명하기 위해 비만의 주요 장기인 부고환 지방조직과 간에서 지방세포생성 및 지방생합성 관련 전사인자와 염증성 사이토카인 관련 유전자 발현을 검토한 결과 세포주에서와 동일하게 케피어는 C/EBP α, PPAR γ, SREBP-1c, aP2, TNF α의 발현을 유의적으로 억제하였다.
이상의 본 연구 결과는 케피어가 지방세포생성 및 지방생합성에 관련한 전사인자를 조절함으로써 지방대사를 조절하고 식이성 비만을 예방 및 개선하는데 기여함을 알 수 있었으며, 향후 케피어를 이용한 항비만 건강기능식품의 개발 또는 항비만 신소재의 실용화 가능성을 시사하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study was performed to investigate the effect of kefir on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes in vitro, and anti-obesity effect in C57BL/6J mice fed normal or high fat diet in vivo. In order to develop functional materials of the anti-obesity, the inhibitors of adipocytes differentiation were screened from three fractions such as kefir’s culture medium (Fr-1) and cold water fractions (Fr-2, Fr-3). Treatment of Fr-3 of cold water extract (0.1 mg/mL) among the three fractions decreased adipocyte lipid accumulation and GPDH enzyme activity. Moreover, the Fr-3 down-regulated dramatically the mRNA expressions of adipogenic and lipogenic transcription factors (C/EBP α, PPAR γ, aP2, SREBP-1c, FAS, ACC), inflammation markers (TNF α) during adipogenesis, compared to the positive control. Thus, the kefir’s insoluble fraction was selected as a candidate of adipocyte inhibitor. In addition to this study was also conducted to investigate the anti-obesity effect of kefir powder on the high fat diet induced obese C57BL/6J mice in vivo. Experimental groups were normal diet group (ND), high fat diet group (HFD), high fat diet + Kefir powder 0.1 % group (HFD-LK), high fat diet + Kefir powder 0.2 % group (HFD-HK) for 8 weeks. Consumption of kefir powder effectively lowered body weight gain, food efficiency ratio, fat accumulation in liver and relative epididymal fat mass compared with those of the high fat diet group. Also, LDL-cholesterol, triglyceride, total cholesterol, AST, ALT levels in the serum were significantly reduced by kefir powder supplementation compared with those of the high fat diet group. Also, the kefir powder increased serum HDL cholesterol level, which was decreased with the high fat diet. In the liver tissue and epididymal white adipose tissue of the kefir diet-fed mice, the mRNA expressions of adipogenic and lipogenic transcription factors (C/EBP α, PPAR γ, aP2, SREBP-1c, FAS, ACC), inflammation markers (TNF α) were significantly decreased. In results, the kefir might inhibit preadipocyte differentiation, adipogenesis and lipogenesis in adipocyte cell line and high-fat diet-induced obese mice.

목차 (Table of Contents)

• Contents
• Abstract i
• Contents iii
• List of Figures viii
• List of Tables xii
• List of Schemes xiii
• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ . Materials 7
• 1. Kefir samples 7
• 2. Chemicals 7
• 3. Cell line and medium 8
• 4. Animals 8
• Ⅲ. Methods 9
• 1. Sample preparation 9
• 2. In vitro experiment 11
• 2.1. Cell culture 11
• 2.2. Differentiation of 3T3-L1 preadipocyte 12
• 2.3. Measurement of 3T3-L1 preadipocyte cell viability 13
• 2.4. Oil red O staining 15
• 2.5. Glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) assay system 17
• 2.5.1. Preparation of crude GPDH solution 17
• 2.5.2. Enzyme assay system 19
• 2.5.3. GPDH activity and specific activity 20
• 2.6. RNA isolation 21
• 2.7. Reverse transcription-polymerase chain reaction analysis 22
• 3. In vivo experiment 24
• 3.1. Experimental design 24
• 3.1.1. Animals and diet 25
• 3.1.2. Blood sample and serum preparation 27
• 3.1.3. Sampling procedure of organs 28
• 3.2. Biochemical analysis 29
• 3.2.1. Serum and liver 29
• 3.2.2. Liver and epididymal adipose tissue histology and mean adipocyte surface area assays 30
• 3.3. Liver and epididymal adipose tissue gene expression 31
• 3.3.1. RNA isolation 31
• 3.3.2. Reverse transcription-polymerase chain reaction analysis 32
• 3.3.3. Statistical analyses 33
• Ⅳ. Results and Discussion 34
• 1. In vitro studies 34
• 1.1. Cell viability test in 3T3-L1 preadipocyte 34
• 1.2. Morphological changes in 3T3-L1 differentiation 36
• 1.3. Inhibitory effect of kefir broth fractions against GPDH activity. 39
• 1.4. Changes of gene expression in 3T3-L1 cell by kefir broth fractions 41
• 1.4.1. Effects of kefir broth fractions on mRNA expression of adipogenic and lipogenic transcription factors 41
• 1.4.2. Effects of kefir broth fractions on mRNA expression of inflammatory cytokines 49
• 2. In vivo studies 52
• 2.1. Body weight gain, food intake, and food efficiency ratio 52
• 2.2. Serum biochemical analysis 55
• 2.2.1. Serum lipid levels 55
• 2.2.2. Serum AST and ALT activities 56
• 2.3. Liver and epididymal adipose tissue weight, histology and adipocyte surface area 58
• 2.4. Hepatic lipid levels 63
• 2.5. Change of gene expression in C57BL/6J mice fed with kefir powder 66
• 2.5.1. Effect of kefir powder on mRNA expression of adipogenic and lipogenic transcription factors, inflammatory cytokines in epididymal adipose tissue 66
• 2.5.2. Effect of kefir powder on mRNA expression of adipogenic and lipogenic transcription factors, inflammatory cytokines in liver 76
• Ⅴ. Conclusion 86
• Ⅵ. References 88
• Abstract in Korean
• Acknowledgment in Korean