시판중인 인공피부모델을 이용한 피부자극 대체시험법의 비교검증연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The purpose of this study was to compare the characteristics and irritation potentials of three commercial reconstructed 3D skin models based on human keratinocytes as alternative skin irritation test, and to perform a proficiency test using one model. The 3D skin models used in the validation study were: KeraSkinTM-VM (Biosolution, Korea), EpiDermTM SIT (EPI-200, MatTek Corparation, USA) and LabCyte EPI-MODEL24 (J-Tec, Japan).
The test substances were applied on the surface of insert cells after a pre-incubation period of 24 hrs. The test substances were completely washed, and then models were post-incubated for 48 hrs. Cell viability was measured by MTT assay to find out if test substances had caused skin irritation.
In the preliminary test, three irritants and three non-irritants were selected from the recommended list of OECD Guidelines 439 (2013 version). In order to validate the proficiency test, additional test substances were used for the 2nd test in a LabCyte model. The six test substances used for the 1st test were: Diethyl phathdate, 4-methylthio-benzaldehyde, 1-decanol, heptanal, methyl stearate, and 1-methyl-3-phenyl-1-piparazi, and the additional seven substances used for proficiency test of the LabCyte model were: naphthalene acetic acid, isopropanol, heptyl butyrate, hexyl salicylate, cyclamen aldehyde, 1-bromohexane, and potassium hydroxide (5% aq.).
We used PBS, DPBS and DW as negative controls, and 5% sodium lauryl sulphate (SLS) as a positive control in according to the OECD guidelines 439 (2013).
Quality control indices of models, such as barrier function (TEER), absorbance of negative control, cell viability of positive control, absorbance of extraction buffer used in MTT assay, acceptability range (upper and lower limit), and results range and consistency between inserts, were in agreement with the acceptance criteria.
Most test substances showed consistent results with the GHS standards in OECD Guideline 439, except the 4-methylthio-benzaldehyde (negative substance in GHS) that showed false positives in all 3 models of the preliminary study. In terms of the proficiency test, in the LabCyte model, all of the 10 test substances showed consistent results with OECD Guideline 439.
Taken all together, results for sensitivity, specificity, and accuracy of the three models were 100, 67, and 83%; however, results from the proficient study, the LabCyte model, had 100% sensitivity, specificity, and accuracy-results that were on par with OECD Guideline.
Our present results indicate that the reconstructed 3D skin model is a good alternative model to a skin irritation test, and the Korean KeraSkinTM-VM model would be a good international model provided that several problems were improved. The LabCyte model could also be considered a suitable alternative model to skin irritation test, given its quality and price.

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 인간 피부세포의 keratinocyte를 이용하여 3차원적으로 재배양한 시판중인 인공피부모델 3종을 이용하여 각각의 특성 및 자극 발현여부 등에 대해 비교 검증하고자 하였다.
국내에서 개발한 모델인 (주)바이오솔루션(Korea)의 KeraSkinTM-VM과 MatTek Corporation (USA)의 EpiDermTM SIT (EPI-200) 그리고 가장 최근에 OECD Guideline에 등재된 J-Tec (Japan)의 LabCyte EPI-MODEL24 모델을 이용하였다. 24시간의 pre-incubation을 거친 후 액체물질과 고체물질을 insert에 직접 도포 하였으며, 세척을 실시한 다음 48시간의 post-incubation을 하였다. 4일째 되는 날 MTT assay를 통하여 세포생존율을 산출하여 시험물질의 자극 유무를 판단하였다.
사용된 시험물질은 OECD Guideline 439(2013년 version)을 참고하여, 3개의 비자극 물질과 3개의 자극물질을 이용하여 1차 시험을 실시하였으며, 이후 LabCyte EPI-MODEL24 모델은 숙련도 물질 10종이 포함되도록 물질을 추가하여 2차 시험을 진행하였다. 3개 모델에 모두 시험을 진행한 6가지 시험물질은 diethyl phathdate, 4-methylthio-benzaldehyde, 1-decanol, heptanal, methyl stearate, 1-methyl-3-phenyl-1-piparazi 등이며, 이후 추가로 사용한 시험물질은 naphthalene acetic acid, isopropanol, heptyl butyrate, hexyl salicylate, cyclamen aldehyde, 1-bromohexane, potassium hydroxide (5% aq.) 등 7가지 물질이었다. OECD Guideline 439에 따라 음성대조군은 각각 PBS, DPBS, DW를 사용하였으며, 양성 대조군은 해당 음성대조군에 5%로 희석한 sodium lauryl sulphate (SLS)를 사용하였다.
품질 기준 검사 시험으로 TEER(전기 저항도 측정), 음성대조군의 흡광도, 양성 대조군의 세포생존율, MTT assay시 추출 용매의 흡광도, 표준편차 허용 범위, 재시험 경계 범주, insert간 결과의 일치성을 확인하였을 때 모두 품질 기준을 통과하였다.
추천물질 중 4-methylthio-benzaldehyde의 경우 GHS에서 비자극성 물질이라 분류되어 있지만 세 모델 모두 자극성인 위양성으로 판단되었다. 이를 제외하면 세 모델 모두 시험 결과가 OECD Guideline 439에 등재된 결과와 매우 유사하게 나왔으며, LabCyte EPI-MODEL24를 이용한 숙련도 시험에 있어서도 10개 기준물질에서 정확도가 모두 일치 하였다.
위의 결과를 종합하면, 세 모델의 평가 결과 민감도 100%, 특이도 67%, 정확도 83%였고, LabCyte EPI-MODEL24의 숙련도 테스트 결과 민감도, 특이도, 정확도 모두 100%로 OECD Guideline의 결과와 매우 흡사한 결과를 볼 수 있다.
본 연구에서는 인간의 피부를 3D 형태로 재구성한 인공피부모델은 피부자극시험으로 좋은 대안이 될 수 있다고 판단된다. 또한 국내의 모델인 KeraSkinTM-VM의 경우 표준편차의 문제점 등을 개선하여 국제모델로 거듭날 수 있다고 고려되며 LabCyte EPI-MODEL24의 모델은 품질이나 결과의 편차, 그리고 배송과 가격을 고려해 보았을 때 국내에서 피부자극 대체시험을 수행하기에 합리적인 모델이라 판단된다.

목차 (Table of Contents)

• 1. 서론 1
• 2. 재료 및 방법 4
• 2.1 시약 및 기기 4
• 2.1.1 시약 4
• 2.1.2 기기 7
• 2.2 인공피부모델 8
• 2.2.1 KeraSkinTM-VM 8
• 2.2.2 EpiDermTM SIT (EPI-200) 8
• 2.2.3 LabCyte EPI-MODEL24 8
• 2.3 Quality control (QC) 지표 9
• 2.3.1 TEER 측정 9
• 2.3.2 음성대조군의 흡광도 10
• 2.3.3 양성대조군의 세포생존율 10
• 2.3.4 용매의 흡광도 허용범위(MTT assay) 10
• 2.4 인공피부모델 자극평가시험 11
• 2.4.1 KeraSkinTM-VM 11
• 2.4.2 EpiDermTM SIT (EPI-200) 13
• 2.4.3 LabCyte EPI-MODEL24 15
• 2.4.4 LabCyte EPI-MODEL24의 세척 방법에 따른 비교 17
• 2.4.4.1 LabCyte EPI-MODEL24의 version 1 방법 17
• 2.4.4.2 LabCyte EPI-MODEL24의 version 2 방법 17
• 2.5 시험의 평가 및 해석 18
• 2.5.1 QC 18
• 2.5.2 자극평가시험의 판별 19
• 2.5.3 OECD Guideline 439 기준 19
• 3. 연구결과 20
• 3.1 QC 20
• 3.1.1 TEER 측정 20
• 3.1.2 음성대조군의 흡광도 21
• 3.1.3 양성대조군의 세포생존율 22
• 3.1.4 용매의 흡광도 허용범위(MTT assay) 23
• 3.2 인공피부모델 자극평가시험 결과 24
• 3.2.1 KeraSkinTM-VM 24
• 3.2.2 EpiDermTM SIT (EPI-200) 27
• 3.2.3 LabCyte EPI-MODEL24 30
• 3.2.4 LabCyte EPI-MODEL24의 숙련도 시험 33
• 3.2.5 Specificity, sensitivity, accuracy 36
• 3.2.6 LabCyte EPI-MODEL24의 세척 방법에 따른 비교 37
• 4. 고찰 38
• 참고문헌 42
• 영문초록 47
• 국문초록 50