Raffinose Synthesis by α-Galactosidase from Absidia corymbifera IFO 8084 : Absidia corymbifera IFO 8084由來α-ガラクトシダ─ゼによるラフィノ─スの合��

국문 초록 (Abstract)

라피노스(Raffinose)는 비소화성 올리고당으로서 지금까지 알려져 있는 올리고당 중에서도 특히 장내유용세균인 비피더스균에 의해서 선택적으로 자화되기 쉬우며, 이 들 세균을 현저하게 증식시키는 효과를 가진 갈락토 올리고당의 일종으로 알려져있다.　본 연구에서는 효소적인 방법에 의하여 고가의 올리고당의 합성공정을 확립하기위하여 새로운 효소를 생산하는 미생물을 검색하고 이를 분자레벨에서 규명함으로써 산업적으로 유용하게 응용하기 위한 기초적 연구를 행하였다. 미생물의 검색결과, 본 연구에서는 사상균인Absidia corymbifera IFO 8084에서 단리한 α-galactosidase가 약10%의 축합전이율로 목적하는 라피노스당을 생산하는것을 확인하였다. 본 연구에서는Absidia corymbifera IFO 8084 유래의 천연α-galactosidase효소를 정제하여 아미노산의 부분배열을 결정하였다. 또한, mRNA를 단리시 이를 주형으로 cDNA를 합성하여 cDNA library를 구축하였다. 아미노산의 부분배열을 이용하여 제작한Probe를 이용하여 cDNA libaray를 검색한 결과 목적한 효소유전자의 80%에 해당하는 유전자를 획득하였다. 최종적으로 RT-PCR을 실시하여 전유전자를 취득시 염기배열을 결정하였다. 취득한α-galactosidase의cDNA는 2,190염기로 구성되어 이들 염기배열은 730개의 아미노산을 코드하고 있으며, 예측되는 단백질 분자량은 82,712Da임이 밝혀졌다. 이러한 결과를 분석비교한 결과Absidia corymbifera IFO 8084 유래의 α-galactosidase효소는 테트라머(tetramer)로 구성되는 올리고머(Oligomer)임이 밝혀졌다. 또한 기존의α-galactosidase유전자배열과 비교분석한 결과 박테리아계의 family36과 높은 상동성을 보였다.　본 연구에서는 취득한 곰팡이 유래의α-galactosidase유전자의 대장균에서의 대량발현을 시도하였다. 즉, 취득한α-galactosidase의 cDNA를 파아지 유래의 강력한 T7프로모터의 하류에 삽입하여 얻어진α-galactosidase의 cDNA클론을 숙주대장균인 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환시킴으로써 단백질의 합성을 유도하였다. 그러나, 본 발현계 (pET21(b＋)/galα)에 의해서 얻어진 단백질은 총 단백질의 20%만이 활성을 소유하고 있으며 나머지의 80%는 세포질 내에서 불용성의 봉입체를 형성함으로써 비활성체 단백질로 발현되었다. 따라서 본 연구에서는 활성단백질을 얻기위하여α-galactosidase의 cDNA를pET32Trx벡터의Thioredoxin배열의 하류에 삽입하여 얻어진pET32Trx /galα를 대장균에 형질전환시킨 결과 가용성 퓨전단백질의 대량발현에 성공하였다. 얻어진 퓨전단백질의 His-tag를 이용하여 일단계로 단일효소를 정제할 수 있었다. 정제된 효소는 온도, pH, 라피노스합성능 등에 있어서Absidia corymbifera IFO 8084 유래의 α-galactosidase천연효소와 동일한 결과를 얻었다. 본 연구에서 얻어진 결과를 기초로Absidia corymbifera IFO 8084 유래의 α-galactosidase효소의 활성부위의 해명과 또한 유전자조작을 통한 변이체를 작성하여 목적하는 올리고당 라피노스의 합성능을 더욱 고조시킨 새로운 효소의 개발이 기대되어 진다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

糖質, 特に砂糖は從來1次機能のエネルギ-源および2次機能の甘味料として他の糖質に比べ非常に優れた味質と物性を用い, 多用されてきた. しかし, 近年になり糖質の過剩攝取による肥滿や成人病の問題の原因物質として認識され, 砂糖の消費は減少傾向が續いている. その流れから, 健康の維持や回復に寄與する, 卽ち, 生理調節機能を有する3次機能としての機能性糖質の要求とそれに應した新たな機能性糖質の開發が重要視されている.
ラフィノ-スは難消化性オリゴ糖の一種類であり, 特にビフィズス菌に選擇的に資化されやすく, これを顯著に增殖される作用があり, 腸內フロ-ラの改善に有效であることが明らかになってきた. また, 最新の硏究報告によるとアトピ-皮膚炎への影響が疑われるカンジダ菌を有意に減少させ, ラフィノ-スの經口投與が有效な治療手段になりうることが明らかになった. その他, ラットをモデルとした一連の硏究によって肝障害(B型肝炎)を抑制することが報告されているし, 齒周病と腸內フロ-ラによる免疫賦活との關連を硏究した例ではラフィノ-ス投與が多型核白血球(好中球)の貪食作用や, マイトジェン(PHA)の刺激による非特異的Tリンパ球幼若化反應を亢進する事などが報告されている. また, 臟器移植の際, 保存液として有效で有り, 卽ち, 生理調節機能性糖質としての役割だかじゃなく多方面のラフィノ-スの利用價値が增加し續けている.
ラフィノ-スは現在, 工業的には砂糖の原料であるビ-トの糖蜜から抽出工程により製造されている(日本甛菜製糖株式會社). しかし, ビ-トの中に含まれているラフィノ-スの含量は0.1%程度と極めて微量であり, 比較的高價なオリゴ糖である. そこで, 酵素合成法によって有用なラフィノ-スをより簡單かつ低コストで生産することが望まれている. ラフィノ-スの酵素合成は糖轉移酵素であるガラクトシルトランスフェラ-ゼによって特異的の合成することが旣に可能であるが, 基質であるUDP-galactoseが非常の高價であり, またこの酵素自體が不安定な性質を持っているためこの方法によるラフィノ-スの合成は現實的に不可能である. 一方, 加水分解酵素であるα-カラクトシダ-ゼ(EC3.2.1.22)は砂糖の結晶化に惡影響を與える有害物質としてのラフィノ-スを除去するため使われてきたが, この酵素の縮合反應, 卽ちラフィノ-スの分解産物である砂糖とガラクトスを基質とした逆反應を利用し, ラフィノ-スを合成出來る可能性がある. さらに, 最近消費が減少し續いている安價の砂糖を利用し, 經濟的に附加價値が高いラフィノ-スを創出できるという有望な方法である. しかし, 一般的に逆反應でオリゴ糖を合成する場合, 轉移反應を利用して合成する時に比べて反應速度が遲いため, 大量の酵素で長時間反應させる必要性が豫想される. また, 特異性が低下し, 生成物は種種の結合樣式のオリゴ糖の混合物になる可能性がある. 從って, オリゴ糖の合成に逆反應を行うためにはより高い特異性を持っている加水分解酵素の利用とその酵素を大量に得る必要が當面課題になってくる.
我我はこのような觀點から有用なラフィノ-スをより經濟的かつ高特異的に生産するためには, Absidia corymbifera IFO 8084のα-ガラクトシダ-ゼ(EC3.2.1.22)がこのような目的に適したことを確認した. 卽ち, 逆反應を引き起こすため受容體として高濃度の砂糖(70%)と特異性を高めるために供與體として低い濃度のα-D-ガラクトス(10%)を採用した反應系を構築し, ラフィノ-スの合成を試み, 10%程度の轉換率を得た. この轉換率はAjisakaらによって報告された轉換率よりやや少ないものであるが, 本酵素の方が高い特異性を持ち, より立體選擇的にラフィノ-スを合成することが分かった.
しかし,絲狀菌であるAbisidia corymbifera IFO 8084が生産するα-ガラクトシダ-ゼの分泌量は非常に少ないため, 安定したラフィノ-スの大量生産を實用化させるためにはより簡單, 且つ大量にこの酵素を得ることが必要である. さらに, 分子レベルでの解析と改變を通して一層逆反應の機能を强化した新しい酵素の開發が期待される. この樣な目的は, 我我はAbsidia corymbifera IFO 8084のα-ガラクトシダ-ゼ遺傳子をcDNAクロ-ニングよって取得し, その鹽基配列を決定した. 取得したcDNAは2,190bpからなり, 730アミノ酸殘基をコ-ドし, そのタンパク質の分子質量は82,712Daと決定された. 推定アミノ酸配列の分析結果, Abisidia corymbifera IFO 8084のα-ガラクトシダ-ゼの構造が4量體であることが明らかになった. このα-ガラクトシダ-ゼ遺傳子の推定アミノ酸配列を旣知のα-ガラクトシダ-ゼ遺傳子と比較したところ, family36と高い相同性を示した.
近年, 遺傳子組換え技術の目覺ましい進展により, 種種の宿主-ベクタ-系を利用し, 組換えタンパク質を大量に生産させることが可能になっている. その中でも, 大腸菌を宿主とする發現系は菌體の增殖速度が早く, 大量培養が簡單であり, 何よりも組換えタンパク質を大量に生産するため, 工業的にみても非常に魅力的なタンパク質生産システムである. 從って, 我我は大腸菌を宿主として選び, Abisidai corymbifera IFO 8084から取得したα-ガラクトシダ-ゼcDNAの大量發現を試みた. α-ガラクトシダ-ゼcDNAを大腸菌用發現ベクタ-pET21b(+)のファ-ジ由來の强力なT7プロモ-タ下流に揷入し宿主大腸菌BL21(DE3)株より供給されるT7RNAポリメラ-ゼにより轉寫させた. しかし, この發現プラスミドpET21(b+)/galαによるα-ガラクトシダ-ゼの菌體タンパク質の20%にも及ぶ大量發現が見られたが全ての發現タンパク質は細胞內で不溶性の封入體を形成し酵素活性は見られなかった. そこで不溶性の封入體を回收し, 8Mの尿素で可溶化後, 段階的に透析の尿素濃度を低下させ, 可溶化の再生を試みたが, α-ガラクトシダ-ゼの活性は見られなっかた.
そこで我我は可溶性發現タンパク質を得るためにcDNAを大腸菌用發現ベクタ-pET32-EK/LICのthioredoxin配列の下流の揷入し, 融合タンパク質發現系を構築した. 構築した發現ベクタ-pET32Trx/galαを大腸菌に形質轉換したところ, 融合タンパク質の大量發現が確認された. さらにベクタ-由來のhistidine tagを利用したアフィニテイ-クロマトグラフィ-により一段階で單一酵素として精製された. 精製酵素の融合タンパク質をenterokinaseによって切斷し, 本酵素のN末端配列を決定したところ, native酵素のN末端配列と同じであった. 精製した融合タンパク質のpHと溫度に對する擧動は, Absidia corymbifera IFO 8084からの精製酵素とほぼ同じであった.
さらにこれらの知見を基に, 活性部位の解明と變異株の作成によるラフィノ-スの合成をさらに效率よく行う優れた新しい酵素の開發が期待できる.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS
• General review = 1
• 1. Raffinose as prebiotics = 1
• 2. Enzymatic synthesis of useful oligosaccharides = 3
• Chapter ONE Raffinose synthesis by reverse hydrolysis of α-galactosidase from Absidia corymbifera IFO 8084 = 19
• Introduction = 19
• Materials and methods = 19
• 1. Purification of α-galactosidase from Absidia corymbifera IFO 8084 = 19
• 2. Raffinose synthesis by reverse hydrolysis = 21
• Results and discussion = 22
• Chapter TWO cDNA cloning of α-galactosidase from Absidia corymbifera IFO 8084 = 32
• Introduction = 32
• Materials and Methods = 32
• 1. Amino acids sequencing of purified α-galactosidase from Absidia corymbifera IFO 8084 = 32
• 2. PCR probe preparation for cDNA library screening = 33
• 3. cDNA library construction = 36
• 4. Screening of cDNA clone of α -galactosidase from Absidia corymbifera = 41
• 5. cDNA cloning of all open reading frame = 43
• Results and Discussion = 44
• Chapter THREE Overxpression of recombinant α-galactosidase in the heterologous host E. coli = 67
• Introduction = 67
• Materials and methods = 68
• 1. Construction of expression vector = 68
• 2. Expression of α-galactosidase cDNA in E. coli = 69
• 3. Purification and refolding of inclusion body = 70
• Results and Discussion = 70
• Chapter FOUR Single step purification and characterization of recombinant fusion α-galactosidase = 80
• Introduction = 80
• Materials and Methods = 80
• 1. Optimization of culture condition for production of soluble α-galactosidase = 81
• 2. Single step purification of recombinant fusion α-galactosidase = 81
• 3. Characterization of recombinant fusion α-galactosidase = 82
• Results and discussion = 82
• GENERAL DISCUSSION (英文總括) = 91
• References = 98
• Acknowledgements = 103