Characterizations of human odorant receptor classes by physicochemical conservations of residues in human odorant receptors

국문 초록 (Abstract)

본 논문에서는 인간 후각 수용체 클래스 간에 나타나는 후각 수용체의 기능 차이를 각 클래스에 속한 후각 수용체의 잔기 상 물리화학적 보존성 차이 관점에서 연구했다. 후각 수용체는 인간의 후각 시스템에서 수많은 외부 후각 물질을 인식한다. 인간의 후각 수용체는 아미노산 서열 간 일치도에 따라 계통학적으로 두 집단으로 구분되며, 구분된 집단은 각각 클래스 1, 2로 불린다. 두 클래스 간에는 후각 수용체가 감지할 수 있는 후각 물질의 물리화학적 성질의 차이 등에서의 기능 차이가 보고되어 왔다. 지금까지 후각 수용체 단백질 서열에 다양한 보존 분석법이 적용되어, 두 클래스 간 기능 차이에 중요할 보존 잔기 혹은 특징이 발견되었다. 한편, 단백질의 구조는 단백질을 구성하는 잔기 간의 상호작용에 영향을 받고, 잔기에 위치한 아미노산의 물리화학적 성질에 따라 그 잔기의 상호작용 양상이 달라지기 때문에 20종류의 아미노산 사이의 물리화학적 유사성 기반의 서열 보존 분석은 단백질의 3차원 구조 형성에 중요할 물리화학적 성질 추출에 유용하다. 하지만, 인간 후각 수용체 클래스 사이의 차이를 분석하기 위해 물리화학적 성질 유사성 기반의 보존 분석을 적용한 사례가 없었다. 본 논문에서는 인간 후각 수용체 두 클래스의 기능 구분에 중요할 물리화학적 보존 성질을 추출하기 위해 물리화학적 보존 분석법을 설계하고 이를 인간 후각 수용체의 단백질 서열에 적용했다. 물리화학적 성질이 보존된 후각 수용체의 잔기를 각 클래스에서의 보존성에 따라 네 집단으로 분류했을 때, 흥미롭게도 각 클래스에서 다른 물리화학적 성질로 보존된 잔기(PDCC)를 발견했다. 이 잔기가 인간 후각 수용체 두 클래스의 기능 구분에 중요한지를 각 클래스 대표 후각 수용체 모델의 각 PDCC가 상대 클래스에서 보존된 물리화학적 성질로 바뀌었을 때, 그리고 보존된 물리화학적 성질이 유지되게끔 아미노산을 치환했을 때의 효과를 확인하고 비교하는 방식으로 검증했다. 한편, 각 PDCC 잔기가 하나의 보존된 집단으로도 인간 후각 수용체의 기능에 중요하게 역할 할지를 동일한 방법으로 확인했다. 실험 결과로부터 개별 PDCC가 인간 후각 수용체 두 클래스의 기능 구분에 중요하지 않을 수 있지만, 보존 집단으로써 PDCC는 개별 잔기보다 인간 후각 수용체의 기능에 더 영향을 줄 수 있음을 확인했다. 이는 각 인간 후각 수용체 클래스에 보존된 물리화학적 성질들이 여러 보존 집단으로서 인간 후각 수용체 간의 기능 차이 이해를 확장할 수 있음을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Odorant receptors (ORs) detect various external odorants in the human olfactory system. Human ORs included in class A G protein-coupled receptors (GPCRs) are phylogenetically divided into two clusters (Class I and Class II ORs) by their sequence identity. Functions of ORs have been reported to be different between the two OR classes. Physicochemical properties of odorants that human ORs recognize were different between the classes. Residues of ORs, which may be responsible for distinguishing functions of ORs between the classes, had been found by various conservation analysis methods applied to amino acid sequences of ORs. However, no study examined conservations of physicochemical features of amino acids in the human OR sequences to analyze the difference between the two human OR classes. To extract physicochemical features of residues which may be responsible for distinguishing functions of ORs, especially recognitions of ligands, between two human OR classes, a physicochemical conservation analysis was designed and applied to amino acid sequences of the ORs. Physicochemically conserved residues of ORs in each class were classified into four groups by conservations in the classes. Interestingly, there were physicochemically differently conserved OR residues between OR classes (PDCCs) that may be one of the critical residues in distinguishing functions of ORs between the classes. To validate the importance of PDCCs in distinguishing functions of ORs between the two classes, PDCCs of a representative OR in each class were mutated to physicochemical features conserved in the other class or to other amino acids that contain the features conserved in the same class. And to examine the functional roles of PDCCs as conserved sets in each class, the same approach was taken. The results suggest that individual PDCCs may not be critical in distinguishing functions of ORs related to recognizing ligands between two human OR classes. PDCCs as conserved sets may more affect ORs than the individual PDCCs. Taken together, physicochemically conserved features as conserved sets in ORs of each human class may widen understanding of functional differences between the human OR classes.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• 1.1 Human odorant receptors and their phylogenetic division into two classes 1
• 1.2 Differences in functions of ORs between two OR classes 1
• 1.3 Differences in conservations of residues between two OR classes and approaches to find the differences 1
• 1.4 Purpose of this study 2
• Ⅱ. Materials and Methods 3
• 2.1 Physicochemical conservation analysis on amino acid sequences of human ORs 3
• 2.1.1 Preparation of human OR sequences and their alignment 3
• 2.1.2 Defining physicochemically conserved amino acid residues in ORs 3
• 2.1.3 Classification of the physicochemically conserved amino acid residues of ORs 4
• 2.2 Molecular dynamics simulation of human ORs 6
• 2.2.1 Preparation of human OR systems 6
• 2.2.2 Production of trajectories of the OR systems by MD simulation 6
• 2.2.3 Analysis of the trajectories 6
• 2.2.3.1 Calculation of standard deviations of RMSD in the trajectories 6
• 2.2.3.2 Dimension reduction of OR coordinates using PCA 6
• 2.3 Overexpression of ORs on a heterologous system 9
• 2.3.1 Preparation of DNA and vectors 9
• 2.3.2 Cell culture 9
• 2.3.3 Transfection of OR genes 9
• 2.4 Measurement of functional expressions of ORs in HEK293T cells 9
• 2.5 cAMP assay in OR expressing HEK293T cells 9
• 2.5.1 Measurement of basal activities of ORs 9
• 2.5.2 Measurement of agonist-induced responses of ORs 10
• Ⅲ. Results 13
• 3.1 Physicochemical conservation analysis on amino acid sequences of human ORs 13
• 3.1.1 Identification of class-specifically physicochemically conserved amino acid residues of ORs 13
• 3.1.2 Identification of PDCCs in human ORs 13
• 3.2 Validation of functional roles of PDCCs in each human OR class 16
• 3.2.1 Backgrounds 16
• 3.2.2 Experimental designs for the validation 16
• 3.3 Functional roles of residue 1.46 in ORs in each OR class as a PDCC 17
• 3.3.1 Roles of residue 1.46 on structures of ORs 17
• 3.3.2 Roles of residue 1.46 on functional expressions of ORs 20
• 3.3.3 Roles of residue 1.46 on activations of ORs 22
• 3.4 Functional roles of residue 2.53 in ORs in each OR class as a PDCC 24
• 3.4.1 Roles of residue 2.53 on structures of ORs 24
• 3.4.2 Roles of residue 2.53 on functional expressions of ORs 26
• 3.4.3 Roles of residue 2.53 on activations of ORs 28
• 3.5. Functional roles of PDCCs in ORs as conserved sets 30
• 3.5.1 Backgrounds 30
• 3.5.2 Roles of PDCCs as conserved sets in structures of ORs 30
• 3.5.3 Roles of PDCCs as conserved sets in functional expressions of ORs 33
• 3.5.4 Roles of PDCCs as conserved sets in activations in ORs 35
• Ⅳ. Discussion 38
• 4.1 Understanding of differences in functions of ORs between two human OR classes 38
• 4.2 Identification of class-specific physicochemical features on conserved residues in human ORs 38
• 4.3 Roles of individual PDCCs on functions of ORs in each human OR class 41
• 4.4 Functional roles of PDCCs as conserved sets in each human OR class 42
• 4.5. Limitations of this study 42
• 4.5.1 Mutation models of ORs in each human OR class 42
• 4.5.2 Examination of roles of PDCCs only in one case of OR in each OR class 43
• Ⅴ. Conclusion 44
• References 45