In vitro에서 선발된 지속성 erm 유전자 함유 그람양성구균의 분자적 특성 = Molecular characterization of constitutive erm gene-carrying strains of gram positive cocci selected in vitro

국문 초록 (Abstract)

국문초록

Macrolide, lincosamide, streptogramin B, ketolide 계 (MLSBK) 항생물질은 서로 다른 화학적 특징을 가지지만 세균의 단백질 합성을 저해하는 유사한 작용을 하므로 이들 MLSBK계 항생물질에 공통적으로 내성을 가지는 세균이 증가하고 있다. MLSBK 항생제 내성은 유도성내성(iMLSBK)과 지속성내성(cMLSBK)으로 나뉘는데, 포도상구균 (Staphylococci)에서는 주로 erythromycin resistance methylase (erm) 유전자인 erm A 와 erm C 유전자에 의해서 일어나게 된다. 유도성내성은 14혹은 15환계 macrolide계 항생물질에 낮은 농도로 노출되었을 때 MLSBK 항생물질에 내성을 가지게 되는 경우이고, 지속성내성은 모든 MLSBK 항생물질에 항상 내성을 가지는 경우이다.
본 연구에서는 유도성내성의 표현형을 보이는 S. aureus (SA) 와 Coagulase negative staphylococci (CNS)중 erm A와 erm C를 가지는 균주를 각각 선발하여, MLSBK 항생제 배지 내에서 지속성내성으로 변이 된 자발적인 돌연변이의 비율을 조사하는 In vitro 실험을 실시하였고, 지속성 내성화 된 돌연변이체의 염기서열을 분석하였다.
실험결과 유도성내성에서 지속성내성으로 변하는 비율은 erm C를 가진 균주가 erm A를 가진 균주 보다 높게 나타났고, 염기서열 분석을 통해 확인한 돌연변이 유형은 일부 염기서열이 결실되거나 일정구간이 중복된 두 가지로 나뉘었다.
erm A를 가진 균주의 돌연변이체는 75%가 결실형이었고 25%는 중복형이었으며, erm C를 가진 균주의 돌연변이체는 모두 결실형인 것을 확인할 수 있었다.
erm A 돌연변이체는 7가지의 돌연변이 유형을 보였는데, 72bp, 95bp, 115bp, 121bp가 결실된 4가지 유형과, 25bp, 25bp(다른 부위), 93bp가 중복된 3가지 유형이었다. erm C 돌연변이체에서는 16bp, 24bp, 56bp, 58bp, 60bp, 68bp, 71bp, 121bp, >154bp가 결실된 9가지 유형을 확인하였다.
실험 결과를 통해 S. aureus 와 CNS 의 균종 차이보다는, 각 균주가 가지고 있는 erm 유전자에 따라 돌연변이의 비율과 유형이 달라짐을 확인하였다.
주요어: MLSBK resistance, Staphylococci, ermA, ermC, iMLSBK, cMLSBK

Abstract

Macrolide, lincosamide, streptogramin B and ketolide (MLSBK) antibiotics are widely used in the treatment of Gram positive bacterial infections. MLSBK antibiotics are chemically different, but have similar inhibitory effects on bacterial protein synthesis. The expanded use of these antibiotics has been accompanied by increased numbers of resistant strains among staphylococci.
The expression of the predominant macrolide resistance genes in staphylococci, erm A and erm C, is either inducible or constitutive. Strains with inducible MLSBK resistance (iMLSBK) demonstrate in vitro resistance to 14 and 15 member macrolides, while appearing susceptible to 16 member macrolides, lincosamides, type B streptogramins and ketolide ; strains with constitutive MLSBK resistance (cMLSBK) show in vitro resistance to all of these agents.
In this study, inducible MLSBK resistance (iMLSBK) phenotype showing four isolates each of S. aureus (SA), coagulase negative staphylococci (CNS) containing erm A or erm C were used. In vitro selection was performed by spontaneous mutation method. The selected mutants were sequenced for detection of structural alteration of mRNA.
The conversion ratio of erm A into constitutive MLSBK resistance strains was lower than erm C.
Sequence alteration of the regulatory region revealed 2 types ; deletion and tandem duplication. In erm A, 75% of mutants were included in the deletion type and the others were tandem duplication. Also, there were only deletion in erm C.
erm A mutants had seven different types of structural alterations : deletions of 72, 95, 115, 121bp and three closely related tandem duplications of 25, 25 (different location), 93 bp. erm C mutants had nine different types of structural alterations : deletions of 16, 24, 56, 58, 60, 68, 71, 121, >154 bp.
There is no noticeable difference between S. aureus and CNS in the result of the experiment. It is ascertained that ratio and pattern of the mutation are changed according to erm gene of each isolate.

Keyword : MLSBK resistance, Staphylococci, ermA, ermC, iMLSBK, cMLSBK

목차 (Table of Contents)

• 목 차
• 국문초록 -------------------------------------------- ⅰ
• 목차 ------------------------------------------------ ⅱ
• List of Tables --------------------------------------- ⅳ
• List of Figures --------------------------------------- ⅴ
• 제 1 장 서론 ----------------------------------------- 1
• 제 2 장 재료 및 방법 ---------------------------------- 13
• 제1절 재료 ----------------------------------------- 13
• 1. 대상균주 --------------------------------------- 13
• 2. 항생물질 --------------------------------------- 13
• 3. 배지 ------------------------------------------- 14
• 제2절 대상균주 선별 -------------------------------- 14
• 1. S. aureus , CNS 수집 ------------------------- 14
• 2. 항생물질에 대한 최소저지농도 (MIC) 확인 -------- 14
• 3. Disc 확산법에 의한 표현형 확인 ----------------- 15
• 4. PCR에 의한 내성유전자 확인 (erm A, erm C) ------ 16
• 제3절 돌연변이체 선발 ------------------------------ 19
• 1. 자발적 돌연변이 선발 --------------------------- 19
• 2. Disc 확산법에 의한 돌연변이체의 표현형 확인 ---- 19
• 3. 생장곡선에 의한 돌연변이체의 표현형 확인 ------- 20
• 제4절 염기서열 분석 -------------------------------- 21
• 1. PCR에 의한 leader peptide 확인 (erm A, erm C) -- 21
• 2. Sequencing ------------------------------------ 22
• 제5절 돌연변이체의 mRNA 조절 부위 2차 구조 확인 ---- 22
• 제 3 장 결과 ---------------------------------------- 23
• 제1절 대상균주 선별 -------------------------------- 23
• 1. S. aureus , CNS 수집 --------------------------- 23
• 2. 항생물질에 대한 최소저지농도 (MIC) 확인 -------- 24
• 3. Disc 확산법에 의한 표현형 확인 ----------------- 24
• 4. PCR에 의한 내성유전자 확인 (erm A, erm C) ------ 24
• 제2절 돌연변이체 선발 ------------------------------ 25
• 1. 자발적 돌연변이 선발 --------------------------- 25
• 2. Disc 확산법에 의한 돌연변이체의 표현형 확인 ---- 26
• 3. 생장곡선에 의한 돌연변이체의 표현형 확인 ------- 27
• 제3절 염기서열 분석 -------------------------------- 27
• 1. PCR에 의한 leader peptide 확인 (erm A, erm C) -- 28
• 2. Sequencing ------------------------------------ 28
• 제4절 돌연변이체의 mRNA 조절 부위 2차 구조 확인 ---- 29
• 1. erm A 돌연변이체의 mRNA 조절 부위 2차 구조 ---- 29
• 2. erm C 돌연변이체의 mRNA 조절 부위 2차 구조 ---- 30
• 제 4 장 고찰 ----------------------------------------- 52
• 제 5 장 참고문헌 ------------------------------------- 57
• Abstract -------------------------------------------- 63
• 감사의 글 ------------------------------------------- 65