Molecular Characterization of Healthy Individuals by Cold-Heat Pattern Identification : A Blood Transcriptome Analysis Study|RISS 상세보기

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Objectives: Korean Medicine (KM) pattern identification comprehensively evaluates the constitution in a healthy state and symptoms in a diseased state. Multi-omics, which enables the integration of complex data, is an appropriate methodology for KM pattern analysis. Cold-heat pattern identification (CHPI) is fundamental in KM diagnosis, making it worthy of comparative analysis. However, no studies have explored the differences between cold pattern (CP) and heat pattern (HP) in healthy individuals, not diseased, using omics. This study aimed to identify genes and pathways differentially expressed according to the CHPI of healthy individuals, focusing on cell metabolism and exploring the various components of clinical phenotypes beyond the limits of single-component indicator analysis.

Methods: A study using a whole-genome transcriptome analysis of whole blood samples was conducted, including 25 healthy participants categorized into the CP (13) and HP (12) groups using a Cold-Heat Pattern Identification Questionnaire (CHPIQ) based on usual symptoms. After venous blood samples were collected from participants, total RNA extraction and sequencing were performed. RNA sequencing (RNA-seq) data were used to analyze the differentially expressed genes (DEGs) between CP and HP in males and females separately, and the results were applied to a volcano plot. Bioinformatic analysis [visualization method] was conducted, including gene set enrichment analysis (GSEA) with Gene Ontology (GO) biological process [network plot], transcriptome profiling on oxidative phosphorylation (OxPhos) [circular heatmap], energy-associated pathways using mitochondria-associated gene lists [heatmap], and pathway enrichment analysis. Pathway enrichment analysis included transcriptome profiling on the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway [mapping] and GSEA with MitoCarta3.0 [lollipop plot].

Results: In the volcano plots for DEG analysis, gene expression levels between the CP and HP groups were significantly different in both males and females (cut-off values: | log2 (fold-change) (lfc) | > 0.3, p < 0.05). In the network plots for GSEA with GO biological process, most of the metabolic process-associated gene sets formed the largest cluster in both males and females (gene set registering values: p < 0.05, false discovery rate [FDR] q < 0.5). Females demonstrated pronounced up-regulation of gene expression in the CP and an apparent difference between the CP and HP, especially in the transcriptome profiling of the OxPhos pathway. Gene expression in the nucleotide synthesis pathway was up-regulated in transcriptome profiling of CP females. Additionally, the gene expression of more calcium-associated pathways was down-regulated in CP and up-regulated in HP of males in lollipop plots for GSEA with MitoCarta3.0.

Conclusion: According to the CHPI, there are differences in the transcriptome profiles associated with energy metabolism and mitochondria in healthy individuals. This study further specifies the diagnostic value of CHPI. These results enable future multi-omics studies on clinically available and objective diagnostic indicators, such as constitutional factors, through single-cell analysis and in-silico metabolic flux simulation.

Key words: Multi-omics; Transcriptome; Cold-heat pattern identification; Energy metabolism; Mitochondria; Oxidative phosphorylation.

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국문 초록 (Abstract)

Objectives: 한의학은 망문문절을 통해 환자의 임상적 특징을 종합적으로 확보하여, 여러 변증 분류체계를 진단과 치료에 활용한다. 그 중에서도 한열 변증은 비교적 증상이 명확하여 임상에서 진단 일치도가 높고, 선행연구를 통해 다양한 목적의 설문도구가 개발되어 있어 활용도가 높다. 한편, Multi-omics는 데이터들의 총체적이고 통합적인 분석이 가능하기 때문에 한의 변증 연구에 적합할 것으로 보인다. 그러나 Omics 방법론을 활용하여 건강한 사람에서의 한증과 열증의 차이를 분석한 연구는 없었다. 이에 건강인의 한열 변증에 따라 세포 대사과정에서 어떤 유전자와 경로가 다른지 확인하고, Multi-omics를 통해 임상 표현형에 대하여 단일성분 지표 분석이라는 한계를 넘어서서 다양한 성분들 간의 변화와 상호작용을 알아보고자 하였다.

Methods: 전혈의 전장유전체에 대하여 전사체 분석을 시행하였다. 25명의 건강한 참가자는 평소 증상 기반 한열 변증 설문지를 사용하여 한증 13명과 열증 12명으로 그룹을 나누었다. 대상자로부터 정맥혈 샘플을 채취한 후 전체 RNA 추출 및 Sequencing을 시행하였다. RNA sequencing (RNA-seq) 데이터는 남녀를 나누어 한열간 Differential expressed gene (DEG) 분석을 시행하였고, 그 결과를 volcano plot에 적용하였다. 또한, 다음과 같은 생물정보학적 분석 [시각화 방법]을 시행하였다: Gene Ontology (GO) biological process를 사용한 Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [network plot], 미토콘드리아 관련 유전자 리스트를 사용하여 산화적 인산화 [circular heatmap]와 에너지 관련 경로 [heatmap]에 대해 시행한 전사체 프로파일링 및 경로 강화 분석. 경로 강화 분석으로는 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 경로에 대한 전사체 프로파일링 [mapping]과 MitoCarta3.0을 사용한 GSEA [lollipop plot]를 시행하였다.

Results: DEG 분석에 대한 volcano plot에서 한증과 열증 그룹 간 유전자 발현 수준은 남녀 모두에서 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났다 (cut-off 값: | log2 (fold-change) (lfc) | > 0.3, p < 0.05). GO biological process를 사용한 GSEA에 대한 network plot에서는 대부분의 대사과정 관련 gene sets가 남녀 각각에서 가장 큰 클러스터를 형성하였다 (gene sets registering 값: p < 0.05, false discovery rate [FDR] q < 0.5). 여성은 대부분 한증에서 유전자 발현의 현저한 상향 조절을 보였으며, 특히 산화적 인산화 경로의 전사체 프로파일링에서 한열간 분명한 차이를 보여주었다. 뉴클레오타이드 합성 경로의 유전자 발현은 여성 한증의 전사체 프로파일링에서 상향 조절되었다. 또한, MitoCarta3.0을 사용한 GSEA에 대한 lollipop plot에서 더 많은 칼슘 관련 경로의 유전자 발현이 남성의 한증에서는 하향 조절되고, 열증에서는 상향 조절되었다.

Conclusion: 건강한 사람에서 한열 변증에 따라 에너지 대사 및 미토콘드리아와 관련된 전사체 프로파일에 차이가 있었다. 본 연구는 한열 변증에 대한 진단적 가치를 보다 구체화하였으며, 향후 Single-cell 분석, in-silico metabolic flux simulation을 통해 Multi-omics data를 구축할 수 있는 토대를 마련하였다. 또한, 한의 임상에서 진단 및 치료 시 활용 가능하고 객관화된 한열 변증 진단 지표에 대한 연구가 가능하도록 방향성을 제시하였다.

Key words: Multi-omics; Transcriptome; Cold-heat pattern identification; Energy metabolism; Mitochondria; Oxidative phosphorylation.

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Objectives: 한의학은 망문문절을 통해 환자의 임상적 특징을 종합적으로 확보하여, 여러 변증 분류체계를 진단과 치료에 활용한다. 그 중에서도 한열 변증은 비교적 증상이 명확하여 임상에서...

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