트롬빈이 뇌에 미치는 독성에 대한 실험적 연구 = Purification and Molecular Cloning of Calobin, a Thrombin-like Enzyme from Agkistrodon caliginosus (Korean Vi , 대장균발현, 유전자분석, 클로닝, 트롬빈유사효소, 한국산독사, 항혈전제

국문 초록 (Abstract)

목적 Thrombin은 serine protease 계열의 효소로 혈액 응고에 관여하나, protease activity로 체내에 다른 기능을 가지고 있다. 뇌세포 배양 실험을 통해 thrombin이 세포의 성장, 발육 및 cell death 또는 cell protection 등의 이원적 기능이 있음이 알려지고 있으나, 그 역할이 불분명하다. 최근 생체 실험을 통해 thrombin이 뇌부종 유발 요인으로 제시되기도 하였다. 그러나 저자들은 thrombin이 직접 뇌손상을 요발할 수 있음을 생체 실험으로 확인하고, 뇌손상 요인으로 thrombin의 역할을 제시하고자 한다.
방법 . Sprague-Dawley 쥐(250~300g)를 실험 동물로하여, pentobabital(50mg/kg)로 마취후, 뇌정위 기구에 머리를 고정하고 기저핵에 Havard Infusion Pump를 이용해 thrombin (rat & bovine)용액을 10㎕/3min로 주입하였고, 또한 thrombin inhibitor (α-NAPAP), receptor antagonist (RPPGF) 및 agonist(TRAP 1, 2)등을 동일한 방법으로 단독 또는 혼합 투여 (20㎕/6min)하였다. Thrombin 주입후 시간 경과에 따라 뇌조직 손상(TTC 염색), 조직 수분 함량, Na, K, Cl등을 측정하였고, MAP-2에 대한 면역 화학 염색을 시행하였으며, 24시간 경과후 α-NAPAP, RPPGF, TRAP 등의 투여에 의한 변화를 측정하였다.
결과 . 1) Thrombin(10U)에 의한 뇌손상은 농도 증가에 비례하며(24시간 18.90±1.03%), 12시간 경과후(2.04±0.91 %)부터 발생하기 시작한 초기 단계였으나, 조직 수분 함량의 변화는 1시간 경과후부터 시간에 비례적으로 증가하여 24시간(4.77±0.12㎖/gDW)경과시까지 증가되었다. 2) TRAP 투여시에는 조직 수분 함량의 변화가 없었다. 3) RPPGF 투여시에는 단독 투여시 조직 수분 함량의 변화가 없었으나, thrombin (10 U)과 혼합투여시 thrombin 투여에 비해 조직 수분 함량이 농도 증가에 비례하여 증가되었다(1mM : 5.12±0.23㎖/gDW, 10mM 5.62±0.19㎖/gDW). 4) α-NAPAP 단독 투여시 농도에 비례하여 뇌손상이 유발되어 10mM 투여시 손상이 없었으나, 10mM 투여시 3.29±0.82% 조직 손상이 발생하였다. 5) Thrombin(10 U)과 α-NAPAP를 혼합투여시 뇌손상이 감소되었으며, 농도 변화에 따라 변화여 0.1mM 투여시 가장 감소하였으며(10.09±1.61%), 0.01mM(11.23±1.87%) 및 0.3mM(15.53±0.91%)에서 변화를 보여 적정 농도가 있음이 추론되었다. 6) MAP-2 염색에서 12시간 경과시부터 확인되기 사작하여 24경과시 뚜렷하게 증가되었다.
결론 . Thrombin의 농도 변화에 따라 뇌손상이 발생, 증가되었으며, 뇌부종은 뇌손상이 발생하기 이전부터 지속적인 증가를 보여 Blood-brain barrier와는 관계가 적었다. 또한 이와 같은 뇌손상은 thrombin inhibitor로 감소되었으며, 그 기전으로는 thrombin receptor와는 무관하며, MAP와의 관련성이 암시되었다. 따라서, Thrombin이 뇌손상을 직접 유발할수 있는 요인으로 제시될 수 있으며, 이에 대한 향후 세부적 기전 연구가 필요하리라 생각된다.