제주도 하계 조간대 해양미생물의 다양성 = Diversity of marine microorganisms isolated from intertidal zone in the summer season of Jeju island

국문 초록 (Abstract)

이번 연구는 제주도 하계 암반 조간대 미생물 다양성을 보기위해 암반 조간대 및 조수 웅덩이에서 서식하고 있는 생물, 저질토 그리고 모래를 채집하여 색소, 단백질분해효소 및 지질분해효소 생성 미생물을 분리하여 생육특성, 생리·생화학적 특성, 색소의 특성 그리고 16S rRNA 유전자 염기서열을 통하여 계통학적인 특성을 분석하였다. 조간대 4개 지점 12개 지역에서 분리된 미생물은 총 850균주를 분리하였는데 그 중 색소를 생성하는 미생물은 136 균주가 분리되었다. 분리된 균주들은 yellow, red, orange, pink 혹은 violet 등으로 색상이 다양했으며 대체적으로 그람음성균이 많이 분포하고 있었다. 운동성 실험에서는 총 136균주 중에 118균주가 운동성을 가지고 있었다. 분리된 미생물은 다양한 온도와 높은 염 농도에서도 성장이 가능하다는 것을 확인 할 수가 있었다. 색소를 추출한 뒤 carotenoid 또는 bacteiochlorophyll의 유무를 확인 한 결과 57균주가 carotenoid의 흡광 범위인 450 ～ 540 nm에서 peak를 나타내었다.
제주도 조간대에서 분리된 색소생성 미생물의 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 계통분류학적으로 어떤 division에 속하는지를 확인 하여 본 결과 제주도 제주시 동부지역에서 분리된 색소생성 미생물들은 Proteobacteria(문)/Gammaproteobacteria(강)의 Pseudoalteromonas속 3균주, Shewanella 속 8균주, Oceanisphaera속 1균주, Vibrio속 1균주, Proteobacteria(문)/Alphaproteobacteria(강)의 Kordiimonas속 1균주, Firmicutes(문)/Bacilli(강)의 Bacillus속 1균주, Bacteroidetes(문)/Flavobacteria(강)의 Tenacibaculum속 2균주가 분리되었다. 제주시 서부지역에서는 Proteobacteria(문)/Gammaproteobacteria(강)의 Pseudoalteromonas속 16균주, Galciecola속 1균주, Shewanella 속 8균주, Vibrio속 3균주, Alteromonas속 3균주, Proteobacteria(문)/Alphaproteobacteria(강)의 Loktanella속 1균주, Tateyamaria속 1균주, Roseobacter속 1균주, Rhodovulum속 1균주, Pseudovibrio속 1균주, Phaeobacter속 1균주, Bacteroidetes(문)/Flavobacteria(강)의 Winogradskyella속 1균주, Cellulophaga속 1균주, Formosa속 1균주, Tenacibaculum속 4균주, Polaribacter속 3균주, Actonobacteria(문)/Actinobacteria(강)/Actinobacteridae(아강)의 Micrococcus속 1균주(JJM12), Firmcutes(문)/Bacilli(강)의 Bacilus속 1균주, Exiguobacterium 속 1균주가 분리되었다. 서귀포 동부지역에서 분리되어진 색소생성 미생물을 분류해 본 결과 Proteobacteria(문)/Gammaproteobacteria(강)의 Pseudoalteromonas속에 포함되는 6균주, Shewanella속 4균주(JJM33, JJM61, JJM90, JJM119), Pseudomonas속 2균주, Microbulbifer속 1균주, Vibrio속 2균주, Alteromonas속 1균주가 분리되었다. Proteobacteria(문)/Alphaproteobacteria(강)의 Loktanella속에서 1균주, Paracoccus속 3균주가 분리되었다. Firmicutes(문)/Bacilli(강)의 Bacillus속에서 3균주, Exiguobacterium속 1균주, Marinibacillus속 1균주가 분리되었다. Actonobacteria(문)/Actinobacteria(강)/Actinobacteridae(아강)의 Micrococcus속에서는 1균주가 분리되었다. Bacteroidetes(문)/Flavobacteria(강)의 Polaribaacteria속 1균주, Donghaeana속 1균주, Winogradskyella속 1균주, Tenacibaculum속에서 1균주가 분리 되었다. 서귀포 서부지역에서 분리되어진 색소생성 미생물은 Proteobacteria(문)/Gammaproteobacteria(강)의 Pseudoalteromonas속의 12균주, Shewanella속 6균주, Alteromonas속 3균주, Serratia속 2균주, Vibrio속 1균주가 분리 되었다. Firmicutes(문)/Bacilli(강)의 Bacillus속 6균주, Sporosarcina속 1균주, Bacteroidetes(문)/Flavobacteria(강)의 Tenacibaculum속 3균주, Bacteroidetes(문)/Sphingobacteria(강)의 Flexibacter속 1균주, Persicobacter속 2균주가 분리되었다. 분리 된 136개의 색소 형성 미생물 중 대부분의 미생물은 Proteobacteria/Gammaproteobacteria그룹 (64%)에 속하였으며 다음으로 Bacteroidetes/Flavobacteria그룹 (13%), Proteobacteria/Alphaproteobacteria (8%), Firmicutes/Bacilli 그룹 (10.8%), Bacteroidetes/Sphingobacteria 그룹 (2.1%) 그리고 Actinobacteria 그룹 (2.1%)에 속하는 것으로 나타났다. 각각의 분류 그룹을 genus 별로 나누어 보면 다음과 같이 나누어 볼 수 있다. 이번 연구에서 분리되어진 색소생성 미생물에서 가장 많은 균주가 분리(64%) 되어진 Proteobacteria의 Gammaproteobacteria 그룹 내에서는 Pseudoalteromonas 속이 42%를 차지하고 다음으로 Shewanella 속이 29.5%, Alteromonas 속과 Vibrio 속이 10.2%를 차지하고 나머지 속은 3% 미만이었다. 제주도 조간대에서 분리 되어진 미생물 중 13%를 차지하는 Bacteroidetes의 Flavobacteria 그룹 내에서는 Tenacibaculum 속의 50%로 가장 많은 부분을 차지하고 있다. 다음으로 Polaribacter 속이 22.2%를 차지하였다. 제주도 조간대에서 분리 되어진 미생물 중 10.8 %를 차지하는 Firmicutes의 Bacilli 그룹에서는 Bacillus 속의 73.3%로 가장 많은 부분을 차지하고 다음으로 Exiguobacterium 속의 13.3%를 차지하였다. Marinibacillus 속과 Sporosarcina 속은 각각 6.7%를 차지하였다. 제주도 조간대에서 분리 되어진 미생물 중 8%를 차지하는 Proteobacteria의 Alphaproteobacteria 그룹 내에서는 Paracoccus속의 27.2%, Loktanella속의 18.2%, Kordiimonas속, Tateyamaria속, Roseobacter속, Rhodovulum속, Pseudovibrio속, Phaeobacter속의 각각 9.1%를 차지하였다. 분리 되어진 미생물 중 2.1%를 차지하는 Bacteroidetes의 Sphingobacteria 그룹 내에서는 Persicobacter속의 66.6%, Flexibacter속이 33.4%를 차지하고 Actinobacteria의 Actinobacteria강 Actinobacteridae 그룹 내에서는 Micrococcus속의 Micrococcus leuteus 3균주가 분리가 되었다.
생리적 특성균으로는 단백질분해효소 활성이 높은 35균주를 분리하였는데 대부분의 그람음성균이었으며, 운동성 실험에서는 총 35균주 중에 33균주가 운동성을 가지고 있었다. 분리된 균주들은 다양한 온도, 높은 염 농도 및 pH에서도 성장이 가능하다는 것을 확인 할 수가 있었다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 한 결과 Proteobacteria(문)/Gammaproteobacteria(강)의 Pseudoalteromonas속 10균주, Vibrio 속 21균주, Ferrania속 1균주, Proteobacteria(문)/Alphaproteobacteria(강)의 Phaeobacter속 1균주, Firmicutes(문)/Bacilli(강)의 Bacillus속 2균주가 분리되었다. 이번 연구에서 분리된 단백질 분해효소 생성 미생물 중 Vibrio 속이 가장 많은 수(21균주, 60%)를 차지하고 있었다. 또한 지질분해효소 생성 미생물 9균주를 분리하였다. 분리균주 모두 운동성을 가지는 그람음성균이었다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 한 결과 Proteobacteria(문)/Gammaproteobacteria(강)의 Pseudoalteromonas속 1균주, Vibrio속 2균주, Alteromonas속 4균주, Paeudoalteromonas속 1균주, Agarivorans속 1균주가 분리되었다. 그람음성세균에서 얻어진 지질분해효소는 대부분의 Pseudomonas속에서 발견이 되었다. 이번 연구에서는 Pseudomonas속과는 다른 그람음성세균중에서 지질분해효소 활성을 갖는 미생물들이 확보되었기 때문에 향후 연구해 볼 가치가 있다고 판단된다. 또한 색소생성 미생물 중 총 8균주가 새로운 종일 가능성이 매우 높게 나타났다. 이들에 대해서는 향후 근연종의 표준균주를 분양받아 배양 특성, 형태적 특성, 생리·생화학적 특성, 화학적 특성, 분자생물학적 특성에 관한 연구가 요구되어진다.
또한 이번 연구에서 제주도 표선면에 위치한 해수욕장 모래에서 분리되어진 JJM85^(T)는 NCBI BLAST search를 해 본 결과 Loktanella hongkongensis와 96% 일치하여 새로운 종일 가능성이 나타나 Loktanella 속 내 표준균주들과 16S rRNA 유전자 염기서열 유사도를 분석해 본 결과 L. hongkongensis UST950701-009P^(T) (95.99%), L. marincola DSW-18^(T) (94.1%), L. rosea Fg36^(T) (93.88%), L. koreensis GA2-M3^(T) (93.88%), L. agnita R10SW5^(T) (93.79%), L. salsilacus LMG 21507^(T) (93.73%), L. fryxellensis LMG 22007^(T) (93.35%), L. atrilutea NCIMB 14280^(T) (93.58%) 그리고 L. vestfoldensis LMG 22003^(T) (93.12%)로 나타났다. 그 중 L. hongkongensis UST950701-009P^(T)와 가장 높은 유사도의 염기서열 상동성을 보여 주었다. 생리 생화학적 특성 실험 및 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 유사도 분석, 계통분석, 지방산 그리고 G+C 함량분석 결과를 종합해 본 결과 JJM85T는 신종임을 확인할 수 있었다. 이에 JJM85^(T)를 Loktanella pyoseonensis 로 명명하여 국내 생물자원센터인 KCTC( Korean Collection for Type Culture)와 독일 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)에 균주를 기탁하여 각각 균주 등록 번호를 받았다(KCTC 22372^(T), DSM 21424^(T)). 염기서열은 EMBL Nucleotide Sequence Database에 등록하여 accession number를 부여 받았다. Strain JJM85^(T)의 accession number는 AM983542이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In this study, we investigated bacterial diversity of intertidal zone in summer season of Jeju Island, They were characterized by determining morphological and physio-biochemical properties, and subjected to comparative analysis of partial 16S rRNA gene sequences. The phylogenic relationship of the domain Bacteria was investigated by performing a comparative sequence analysis of PCR-amplified 16S ribosomal RNA in organism of intertidal zone. Microorganisms isolated from marine organisms and investigated analysis of 16S rRNA sequence. The 16S rRNA genes were amplified by using oligonucleotide primers (27F and 1492R). Phylogenetic diversity and taxonomic position of pigment-producing, protease-producing and lipase-producing bacterial isolates were discussed.
A total of 850 marine bacteria were isolated from various substrates. Among them, 136 strains produced several kinds of pigments, 35 strains produced protease, and 9 strains were lipase-producer. They showed growth in the various range of temperture, pH and NaCl. By comparative study of partial 16S rRNA gene sequences, 136 isolates were divided into 6 major groups: Proteobacteria/Gammaproteobacteria (64 %), Bacteroidetes/Flavobacteria (13 %), Firmicutes/Bacilli (10.8 %), Proteobacteria/Alphaproteobacteria (8 %), Bacteroidetes/Sphingobacteria (2.1 %) and Bacteroidetes/Actinobacteria (2.1 %). 35 protease-producing strains were divided into 3 major groups: Proteobacteria/Gammaproteobacteria (91.4 %), Proteobacteria/Alphaproteobacteria (2.8 %) and Firmicutes/Bacilli (5.8 %).
Among these, Gammaproteobacteria group was the largest and distributed in the genera Pseudoalteromonas (10 strains), Vibrio (21 strains)( and Ferrania 1 strain). All of the lipase-producers (9 isolates) were contained in several genera of the Gammaproteobacteria: Shewanella (1 strain), Vibrio (2 strains), Alteromonas (4 strains), Paeudoalteromonas (1 strain) and Agarivorans (1 strain).
On the other hand, it was strongly suggested that 8 isolates was candidates of new species based on low 16S rRNA gene sequence similarity. They were distributed in the families Alteromonasdaceae (JJM10 and JJM57), Pseudoalteromonadaceae (JJM39 and JJM137) and Shewanellaceae (JJM25 and JJM33) of the order Alteromonadales (the class Gammaproteobacteria). Strain JJM84 belonged to the family Flavobacteriaceae of the order Flavobacteriales, the class Flavobacteria. On the other hand, strains JJM85 represented a novel species of the genus Loktanella in the family Rhodobacteraceae (the class Alphaproteobacteria) on this basis of the phenotypic features and phylogenetic evidence, for the name Loktanella pyoseonensis sp. nov. is proposed.

목차 (Table of Contents)

• PART Ⅰ. 제주도 조간대 해양미생물의 계통학적 분석 = 1
• ABSTRACT = 2
• 1. 서론 = 3
• 2. 재료 및 방법 = 13
• 2.1. 연구지역 개황 = 13
• 2.2. 생물 시료 채집 방법 = 16
• 2.3. 환경요인 분석 = 16
• 2.4. 종속영양세균 분석 = 16
• 2.5. 미생물 분리 = 17
• 2.6. 미생물 분리 방법 = 20
• 2.6.1. 해양 미생물의 분리 = 20
• 2.6.2. 해양 생물체로부터 미생물 분리 = 20
• 2.6.3. 해양 퇴적토 시료로부터 미생물 분리 = 20
• 2.7. 분리된 미생물의 형태 및 생리 · 생화학적 특성조사 = 21
• 2.7.1. Gram staining, Oxidase and Catalase test = 21
• 2.7.2. 성장 온도 및 pH 실험 = 21
• 2.7.3. 염분 실험 = 21
• 2.7.4. 운동성 시험 = 22
• 2.7.5. Tween 40 및 80 가수분해 실험 = 22
• 2.7.6. API kit을 이용한 생화학적 특성 조사 = 22
• 2.7.7. 색소 추출 = 23
• 2.8. 16S rRNA 염기서열 분석 = 24
• 2.8.1. Genomic DNA 분리 = 24
• 2.8.2. 16S rRNA 유전자 증폭 = 24
• 2.8.3. 16S rRNA 유전자 염기서열 결정 = 24
• 2.9. 계통 분석 = 25
• 3. 결과 및 고찰 = 26
• 3.1. 채집시료 = 26
• 3.2. 환경요인분석 = 31
• 3.2.1. 수온, pH 및 염분 = 31
• 3.2.2. 용존산소와 화학적 산소요구량 = 31
• 3.2.3. 영양염류 = 31
• 3.2.4. 종속영양세균 = 32
• 3.3. 분리균주의 특성 = 34
• 3.3.1 색소생성 미생물 = 34
• 3.3.1.1. 분리균주의 색소 특성 = 45
• 3.3.1.2. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 및 계통분석 = 49
• 3.3.2. 생리적 특성균 = 73
• 3.3.2.1 단백질 분해효소 생성 미생물의 특성 = 73
• 3.3.2.2. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 및 계통분석 = 77
• 3.3.2.3. 지질 분해효소 생성 미생물의 특성 = 84
• 3.3.2.4. 16S rRNA 염기서열 분석 및 계통분석 = 88
• 3.4. 신종 후보 미생물 = 94
• 4. 요약 = 96
• PART Ⅱ. 신규 미생물 Loktanalla pyoseonensis sp. nov.의 다상적 분류 = 99
• ABSTRACT = 100
• 1. 서론 = 101
• 1.1. 새로운 미생물의 중요성 = 101
• 1.2. 미생물의 진화 = 103
• 1.3.미생물 분류(Microbialtaxonomy) = 108
• 1.4. 분자생물학적 접근의 필요성 = 114
• 1.5. Phylum Proteobacteria = 115
• 1.6. Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Loktanella = 119
• 2. 재료 및 방법 = 121
• 2.1. 미생물 분리 및 보존 = 121
• 2.2. 표현형적 특성 분석 = 122
• 2.2.1. 표준균주 및 참조균주 = 122
• 2.2.2. 형태적 특성 분석 = 122
• 2.2.2.1. Gram staining = 122
• 2.2.2.2. 운동성 실험 = 122
• 2.2.2.3. Scanning Electron Microscopy (SEM) = 123
• 2.2.3. 생리 · 생화학적 특성 분석 = 124
• 2.2.3.1. Oxidase and Catalase test = 124
• 2.2.3.2. 성장 온도 및 pH 실험 = 124
• 2.2.3.3. 염분 실험 = 125
• 2.2.3.4. Agar, DNA 그리고 Starch 분해 실험 = 125
• 2.2.3.5. Casein 가수분해 실험 = 125
• 2.2.3.6. Cellulose 가수분해 그리고 Flexirubin pigment 생산 실험 = 125
• 2.2.3.7. Chitin, Tween 20, 40 그리고 80 가수분해 실험 = 125
• 2.2.3.8.APIkit을 이용한 생리,생화학적 특성 조사 = 126
• 2.3. 지방산 분석 = 126
• 2.4. G+C 함량 (mol/%) 분석 = 129
• 2.5. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 = 129
• 2.6. 계통 분석 = 130
• 3. 결과 및 고찰 = 132
• 3.1. 표현형적 특성 분석 = 132
• 3.2. Scanning Electron Microscopy (SEM) = 135
• 3.3. 지방산 분석 = 136
• 3.4. G+C contents (mol%) = 140
• 3.5. 16S rRNA 유전자 염기서열 및 계통 분석 = 141
• 4. 요약 = 147
• 종합요약 = 149
• 참고문헌 = 153
• 감사의 글 = 168