베게너 육아종증에서 인터루킨-32의 역할 규명 = Role of Interleukin-32 in Wegener`s granulomatosis

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

1. Goals
The one of our goal in this study is the functional study of new cytokine, interleukin-32 (IL一32), in Wegener, s granulomatosis (WG). And the other goal is the development of more effective diagnosis and treatment of Wegener’ s granulomatosis (WG) by the discovery of its actual cause
2. Purposes and Necessities
WG is a life-threaten chronic inflammatory autoimmune disease which causes granuloma and necrotic vasculitis. There are many reports about WG but the cause is still unknown. So, the present treatment for patients is anti-inflammation and immune suppression drugs for relief of clinical signs. But the toxicity and side effect of them suppress bone marrow and increase infections. The IL-32 is known as binding protein of PR3. The PR3 is the antigen for proteinase 3-antineutrophil cytoplasmic antibodies (PR3-ANCA) which is associated with WG. The IL-32 not only induces IL-β，TNF-α, and IL-6 as an inflammatory cytokine but also differentiates monocytes to macrophage-like cells. These characters possess the possibility that IL-32 acts as a major role to progression of inflammation and granulomatogenesis in WG. So, to study of major mediators, which mainly affect to characteristic inflammatory responses in WG such as cytokines, could contribute to clarify cause and to find treatment of WG.
3. Results
- We confirmed that the expression level of IL-32 and PR3 was increased in WG, and this increasement started mRNA stage.
- We isolated blood cell from WG patients, and analysis inflammatory cytokines after treatment of LPS. Different with normal healthy people, Inflammatory cytokines were barely changed in WG patients except the IL-6 slightly increased.
- We observed polynuclear white blood cells of WG patients by immunofluorescence. The expression of IL-32 and PR3 was increased and obtained partial colocalization.
- We choose two patients showing clear clinical sign and high expression of IL-32 and PR3. We analysis blood sample of that patients for evaluation of IL-32, PR3, TNFα and IL-6 before and after treatment. The clinical sign of patient whose IL-32 and PR3 expression was decreased, was improved. But the clinical sign of patient whoes IL-32 expression is barely changed but PR3 expression is halfly decreased, was not improved.
一 We analysis of blood sample for IL-32 autoantibody, PR3 autoantibody, complex form of IL-32/autoantibody and complex form of PR3/autoantibody. The increased levels of IL-32 and PR3 as well as of their complex form of ligand/autoantibodies were tightly associated in WG patients.
4. Application plans of results
The present treatment of WG is not direct treatment about causes but indirect treatment about clinical sign such as anti-inflammatory and immune suppression drugs. But there is serious side effects. Also, the diagnostic method using PR3-ANCA is known as high accuracy and specificity. But there are some cases PR3-ANCA test was negative but a severe clinical sign was occurred. And there are many other auto-immune disease that PR3-ANCA test was positive. So, to define cause and to improve diagnostic method of WG is necessary. We confirmed the correlation among WG, ll_一32， and complex form of IL-32/autoantigen. Especially, the IL-32 is more effective marker for evaluating clinical sign and predicting prognosis. Therefore, we expect that the functional study of IL-32 in WG w川 contribute to the understanding of WG etiology and improving of diagnostic method.

국문 초록 (Abstract)

1. 연구목표
베게너 육아종증(Wegeners granulomatosis)에서 신규 사이토카인 인터루킨-32(lnterleukin-32)의 역할 규명 및 지금까지 설명되지 않은 발병 원인을 밝혀 보다 효과적인 진단 및 치료 방안 발굴을 목표로 함.
2. 연구 개발의 목적 및 필요성
베게너 육아종증은 육아종 및 괴사성 전신 혈관염을 유발하는 치명적 만성 염증성 자가 면역 질환임. 베게너 육아종증과 관련하여 보고들이 지속되고 있음에도，정확한 발병 원인은 밝혀지지 않고 있음. 따라서 현재 환자의 치료는 증상을 완화시키기 위한 항염증제와 면역억제를 병합 사용하고 있음. 그러나 약물의 강한 독성과 비 특이적 작용 기전이 골수 백혈구의 생성을 억제시켜 감염 위험을 크게 증가시킨다고 보고됨. IL-32는 이 질환과 관련된 항호중구성 세포질 항체(PR3-ANCA)의 항원인 proteinase 3(PR3)와 결합하는 것으로 밝혀짐. 특히 IL-32는 전염증성 사이토카인으로서 IL-1β, TNF-α, IL-6등을 유도할 뿐만 아니라，단핵구(monocyte)를 대식세포 유사세포(macrophage-like cell)로 분화시키는 기능이 알려짐. 이러한 특징은 베게너 육아종증에서 염증의 진행과 육아종 형성에서 IL-32가 주요한 역할을 할 가능성을 가짐. 따라서 베게너 육아종증의 특징적인 염증 반응에 중요한 영향을 미치는 사이토카인, 세포결합 단백질 등과 같은 주요 매개체를 규명하는 것은 이 질환의 병인 규명과 치료 방안 연구에 크게 기여할 수 있음.
3. 연구 개발 결과
- 본 연구진은 베게너 환자의 혈청 중에서 IL-32와 PR3의 단백질 발현이 높다는 것을 확인하였으며 Northern blotting을 통하여 이러한 IL-32의 발현 증가가 mRNA 단계에서부터 일어난다는 점을 확인하였음.
- 본 연구진은 베게너 환자의 혈구 세포를 분리, LPS를 처리한 후 발현되는 염증성 사이토카인들을 측정하였음. 베게너 환자의 경우 IL-6가 약간 증가한 것을 제외하면 정상인의 혈구세포에 비해 염증성 반응의 차이가 크지 않다는 것을 확인하였음.
- 본 연구진은 베게너 환자의 다핵성 백혈구에 대한 면역형광염색을 통해 IL-32와 PR3 단백질이 정상인에 비해 높게 발현되는 것을 관찰하였고，IL-32와 PR3는 일부분만이 colocalization된다는 것을 확인하였음.
- 본 연구진은 뚜렷한 임상 증상을 나타내면서 IL-32와 PR3의 발현량이 높은 2명의 환자를 선정, 치료전후에 혈청 내 IL-32, PR3, TNFα , IL-6의 발현량을 측정하였음. IL-32와 PR3의 발현량이 동시에 감소한 환자의 경우 임상 증상이 호전 된 것을 확인하였음. PR3의 발현량은 절반으로 감소하였으나 IL-32의 발현량에는 큰 차이가 없는 환자의 경우 임상 증상 역시 크게 개선되지 않았다는 것을 확인하였음.
- 본 연구진은 베게너 환자의 혈청에서 IL-32와 PR3 각각에 대한 자가 항체, 그리고 리간드와 자가 항체 결합체의 발현량을 분석하였음. 그 결과 IL-32와 PR3 뿐만 아니라 그들의 자가 항체와 리간드-자가 항체 결합체 역시 질병과 밀접한 연관성을 갖는다는 것을 확인함.
4. 연구 개발 결과의 활용 계획
현재 베게너 육아종증의 치료법은 원인에 대한 직접적인 치료가 아니라 염증 증상에 대한 항염증제와면역억제제 등의 대증 요법만이 이루어지고 있으며 약물 독성으로 인한 부작용이 심각함. 또한 현재 PR3-ANCA를 이용한 진단 방식은 비교적 높은 정확성과 특이성을 보이는 것으로 알려져 있으나 PR3-ANCA가 음성임에도 활발한 임상 증상을 나타내는 경우나, 다른 자가 면역 질환들에서도 PR3-ANCA의 발현이 보고됨에 따라 진단 방식에 개선이 필요함. 해당 과제를 통해 본 연구진은 베게너 육아종증과 IL-32 그리고 IL-32 리간드-자가 항체 결합체의 상관관계를 확인함. 특히 임상 증상과 예후 예측에 있어 PR3보다 더욱 정확한 지표로 작용하는 것을 밝힘. 따라서 베게너 육아종증에 있어서 IL-32의 기능 연구를 통해 베게너 육아종증의 정확한 병인을 밝힐 수 있을 뿐만 아니라 진단과 예후를 파악할 수 있는 지표로 이용할 수 있을 것이라 기대함.