Studies on the redox regulation of Bcl-2-transfected L929 cells

국문 초록 (Abstract)

종양괴사인자에 대한 bcl-2의 방어기작을 규명하기 위해서 L929 세포에 bcl-2 유전자를 넣어 bcl-2 영구발현 L929 세포주들을 확립하였다. 종양괴사인자와 actinomycin D에 대해서 bcl-2 발현 L929 세포주들간에 다른 방어정도를 나타냈다. 다른 방어 정도를 나타내는 bcl-2 발현 L929 세포주들 중 두 세포주를 선택하여 R1과 R2라고 명명하고 종양괴사인자에 대해 다른 방어정도가 다르게 나타나는 원인을 규명하고자 하였다. 종양괴사인자 처리시 R1과 R2는 L929 세포에 비해서 증가된 방어효과를 보였다. 반면에 종양괴사인자와 actinomycin D를 함께 처리하였을 경우 R1은 여전히 방어효과를 나타냈으나, R2의 경우는 오히려 L929 보다도 약하게 나타났다.
종양괴사인자 처리시 R1과 R2 의 NF-κB의 활성이 증가되었고 , L929 세포에서는 NF-κB의 활성이 나타나지 않았다. 종양괴사인자 처리시 R1의 AP-1 활성은 L929 세포보다 감소되었고 종양괴사인자와 actinomycin D를 함께 처리하였을 경우 R1의 AP-1 활성은 L929 세포에 비해서 감소하였으나 R2의 활성은 오히려 증가하였다. 활성산소 역시 종양괴사 처리시엔 R1의 활성산소생성량이 L929 세포에 비해서 감소되었고 종양괴사인자와 actinomycin D 처리시 R1의 활성산소생성량은 L929 세포보다 감소하였으나 R2의 활성은 증가하였다. 이상의 실험결과로부터, 종양괴사인자의 신호전달기전에서 AP-1과 NF-κB의 활성 사이의 균형은 bcl-2 발현 L929 세포주들의 방어기전에 주요요인으로 작용하는 것으로 결론지을 수 있다. 또한, AP-1과 NF-κB의 활성은 ROS의 생성량과 상관관계가 있으며 이들에 의해서 조절받는 것을 알 수 있다.
Caspase가 bcl-2 발현 L929 세포주들의 방어기전에 관여하는지의 여부를 알기 위해서 caspase의 inhibitor인 zVAD-fmk를 처리한 결과, 세포사멸을 일으키는 caspase의 억제와 상관없이 각 세포주들의 세포사멸이 증가한다. 이로 미루어 보아서, csapase는 bcl-2 발현 L929 세포주들의 방어기전의 차이에 관여하지 않음을 알 수 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

To investigate the protection mechanism of Bcl-2 against tumor necrosis factor(TNF)-mediated cell death, the Bcl-2 gene was transfected into the L929 cells and stably expressed. Two kinds of clones having different sensitivity against TNF and actinomycin D treatment have been isolated, and named R1 and R2. Upon treatment with TNF, R1 and R2 were more resistant than control L929 cells against TNF cytotoxicity. In case of TNF plus actinomycin D treatment, R1 was resistant against TNF cytotoxicity, whereas R2 became more sensitive than control L929 cells.
Furthermore, R1 and R2 showed higher NF-κB activities than control L929 cells. AP-1 activity and ROS formation of R1 were suppressed upon TNF treatment. In case of TNF plus actinomycin D treatment, R2 showed a remarkable increase of AP-1 activity and ROS formation and they were much higher than that of control L929 cells. These data suggest that the balance between NF-κB and AP-1 may play an important role in the TNF sensitivity in Bcl-2 transfected L929 cells and regulated by ROS.
Pan-caspase inhibitor zVAD-fmk could block cytotoxicity in neither R1 nor R2 cell. These results implicate that redox regulation of the TNF sensitivity in Bcl-2-transfected L929 cell was not through caspase cascade but through counteraction between NF-κB and AP-1 signaling pathway.

목차 (Table of Contents)

• Table of contents = ⅰ
• List of figures = ⅲ
• Abbreviations = ⅴ
• Abstract = ⅵ
• Ⅰ. Introduction = 1
• Ⅱ. Materials and methods = 7
• Ⅱ-1. materials = 7
• Ⅱ-2. cell culture = 7
• Ⅱ-3. MTT assay = 7
• Ⅱ-4. ROS measurement = 8
• Ⅱ-5. EMSA = 8
• Ⅲ. Results = 10
• Ⅲ-1. Bcl-2 regulates the level of ROS production = 10
• Ⅲ-2. Redox regulation of transcription factor induced by TNF or TNF plus actinomycin D = 11
• Ⅲ-3. NAC sensitizes control L929 cells, R1, and R2 to TNF-induced cell cytotoxicity through down regulating ROS level = 12
• Ⅲ-4. Caspase is not involved in the TNF sensitivity in Bcl-2 transfected cells = 13
• Ⅳ. Discussion = 14
• Ⅴ. References = 31
• Ⅵ. 국문요약 = 42