Anti-fibrotic effects of synthetic TGF-β1 and Smad oligodeoxynucleotide by regulation of both epithelial and endothelial to mesenchymal transition on renal fibrosis

국문 초록 (Abstract)

목적: 만성 신장질환의 일반적인 병리학적 특징은 세뇨관 간질과 사구체의 손상, 만성 염증반응, 신장섬유화 및 신부전이다. 신장섬유화는 병인에 관계없이 신부전의 최종 단계로 이어지는 일반적인 경로로 신장 혈관의 위축과 팽창, 사구체 염증 세포의 침윤, 근섬유모세포의 축적 및 세포외기질 성분의 과도한 축적의 특징을 가진다. 세포외기질의 축적은 대표적인 섬유증의 특징으로 이를 생산해 내는 대표적인 세포가 근섬유모세포이다. 근섬유모세포의 활성화에 다양한 세포들이 관여한다고 알려져 있다. 그 중에서 혈관 상피세포와 내피세포가 주요 근원이다. 혈관 상피세포와 내피세포는 상피 중간엽 전이(epithelial to mesenchymal transition, EMT)와 내피 중간엽 전이(endothelial to mesenchymal transition, EndoMT)를 통하여 본래의 특징을 잃고 중간엽 세포의 특징을 가지는 과정을 통하여 근섬유모세포로 활성화 된다. 신장섬유화와 EMT 그리고 EndoMT 과정에 관여하는 여러 cytokine과 신호전달 중에서 가장 대표적인 것은 TGF-β1/Smad 신호전달 경로이다. TGF-β1은 수용체와 작용하여 하위 신호전달 경로인 Smad 신호전달을 활성화시키고 섬유아세포를 활성화시켜 세포외기질의 생성을 유도한다고 알려져 있다. 따라서, 본 연구에서는 TGF-β1 mRNA와 Smad 전사인자를 동시에 차단하는 이중 기능성 합성 TGF-β1/Smad oligodeoxynucleotide (ODN)을 합성하여 신장섬유증에서 효능을 확인하였다.
방법: TGF-β1/Smad 신호전달 경로를 억제하기 위하여 TGF-β1/Smad ODN을 합성하였다. 본 실험은C57BL/6쥐의 좌측 요관을 상하로 결찰하여 폐쇄하는 편측성 요관 폐쇄 모델(UUO)로 신장섬유화를 유발하였으며, 신장 혈관 상피세포(NRK-52E)에 TGF-β1을 처리하여 신장섬유화 세포 모델을 수립하였다. 신장섬유화 동물 모델과 세포 모델에 합성 TGF-β1/Smad ODN을 투여하여 치료 효과를 조사하였다. 먼저 FITC형광 라벨을 한 ODN을 쥐와 세포에 투여하여 형질감염이 잘 되었는지 확인하였으며, EMSA와 Real-time PCR을 통하여 합성 TGF-β1과 Smad 발현량 변화를 조사하였다. 신장 기능을 평가하기 위하여 쥐의 혈청에서 크레아티닌과 혈액 요소 질소를 측정하고, 염증성 cytokine의 변화를 알아보기 위하여 ELISA를 수행하였다. 또한 신장섬유증과 병리학적 변화 및 세포외기질의 축적 정도를 조직학적 염색, Real-time PCR 및 Western blot으로 확인하였다. 근섬유모세포의 활성화와 EMT, EndoMT 현상을 조사하기 위하여 면역형광염색과 Western blot, 면역화학염색을 수행하였으며, 세포에서도 면역형광염색과 Western blot 실험을 통하여 섬유화 억제 효과를 조사하였다.
결과: FITC 형광 라벨을 한 TGF-β1/Smad ODN을 투여한 결과 신장 내 및 NRK-52E 세포 내에 안정적으로 주입된 것을 확인하였다. 크레아티닌과 혈액 요소 질소를 측정한 결과 UUO로 일어난 신장 기능 이상은 TGF-β1/Smad ODN으로 인하여 개선된 것을 확인 할 수 있었다. ELISA와 Real-time PCR 실험의 결과로 UUO 수술 이후 일어난 염증 반응 또한 TGF-β1/Smad ODN으로 인해 감소하는 것을 알 수 있었다. H&E 염색과 Trichrome 염색을 통해 UUO 그룹에서 신장 혈관의 파괴와 팽창 및 콜라겐 형성이 일어난 것을 확인 하였고, 이러한 현상은 TGF-β1/Smad ODN의 투여로 억제된 것을 확인하였다. 세포외기질인 fibronectin과 근섬유모세포의 특이적 마커인 alpha-smooth muscle actin (α-SMA)와 fibroblast-specific protein 1 (FSP1)을 면역화학염색과 Western blot, 면역형광염색으로 확인 한 결과, UUO 그룹과 TGF-β1 처리한 NRK-52E 세포에서 발현량이 증가하였고 TGF-β1/Smad ODN 을 처리한 그룹에서 발현량이 줄어드는 것을 확인하였다. EMT와 EndoMT현상을 보기 위한 면역형광염색 결과는 UUO 그룹에서 관련 마커들의 변화가 일어났지만, TGF-β1/Smad ODN에 의해 EMT와 EndoMT 현상이 억제되는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 Western blot 결과는 UUO로 인해 세포외기질이 축적되고 TGF-β1/Smad 신호전달이 활성화 되었으나 TGF-β1/Smad ODN에 의해 억제되는 것을 확인하였다.
결론: 본 연구에서는 합성 TGF-β1/Smad ODN이 신장섬유화에 미치는 영향을 확인하기 위해 실험을 진행하였다. TGF-β1/Smad ODN은 효과적으로 TGF-β1/Smad 신호전달을 억제하여 신장섬유화 모델에서 TGF-β1과 Smad 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 신장섬유화 모델에서 증가하였던 염증반응, 세포외기질의 축적 및 근섬유 모세포의 활성은 TGF-β1/Smad ODN을 투여함으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 EMT와 EndoMT 현상을 관찰함으로써, UUO로 일어난 EMT와 EndoMT 현상은 합성 TGF-β1/Smad ODN을 투여함으로써 억제되는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 근섬유모세포의 근원으로 혈관 상피세포와 내피세포가 기여할 수 있다는 것을 확인하였으며, 결론적으로 합성 TGF-β1/Smad ODN은 신장섬유화의 예방 및 치료제로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 4
• 3. Results 12
• 4. Discussion 18
• 5. References 34