분변에서 분리된 Vancomycin-resistant Enterococcus의 항생제내성 유전자형 분석 및 내성획득기전 = Analysis of Antibiotic Genotype and Resistance-Acquired Mechanisms of Vancomycin-Resistant Enterococcus spp Isolated from Stool

국문 초록 (Abstract)

배경 : 장구균은 장내세균총의 위장관의 정상 상재균으로 대부분 대변배양을 통하여 분리되며 소수에서 구강 내 또는 여성생식기의 질내 상재균으로 분리되는 비교적 독성이 약한 병원성균이다. 임상에서 분리되는 장구균의 80-90%는 E. faecalis이고 5-10%는 E. faecium이지만 수년전부터 미국의 대형 병원을 중심으로 다약제내성을 보이는 E. faecium이 등장해 중요한 병원감염균으로 대두되고 있다. 프랑스와 영국에서 Vamcomycin에 내성을 나타내는 vanA를 가진 E. faecium가 처음 보고된 이래 VRE는 각 병원의 면역이 저하된 중환자실 환자들을 중심으로 급증하고 있고 이런 VRE의 내성유전자는 다른균으로 전이가 가능하여 임상적으로 심각한 문제가 되고 있다.
목적 : 본 연구에서는 최근 환자에서 분리되는 VRE을 검출하여 VRE의 항생제 내성유전자형과 내성획득기전에 대해 알아보고 VRE가 vancomycin이 존재하지 않는 환경에서 내성유전자가 자연적으로 소실이 가능한지와 반대로 표준균주 E. faecalis와 E. faecium이 vancomycin 존재 하에서 자연적 내성유전자의 획득이 가능한지를 항생제 감수성과 내성유전자 분석을 통해 알아보고자 한다.
방법 : 2008년 6월부터 2009년 1월까지 종합병원에서 분리된 Enterococcus균주를 Gram stain, Catalase test, 디스크확산법(disk diffusion), 자동동정기기인 Vitek GPI, GPS-451와 PCR을 이용하여 VRE의 항생제 내성의 표현형과 유전자형을 동정하였으며 동정된 VRE은 자연계대배양을 통해 VRE 유전자의 지속성검사를 하였고 항생제 내성획득실험을 위해 표준균주 E. faecalis와 E. faecium을 vancomycin 농도별 차이를 두어 성장속도 변화와 항생제 감수성검사를 실시하였다. 분리된 VRE을 표준균주에 전이시키기 위해 Liquid mating(1:4), Solid mating(1:1)과 Filter mating(1:10)을 이용하여 유전자 전이를 실시하였다.
결과 : 동정된 VRE는 E. gallinarum이 45.4% E. faecium이 54.5%로 검출되었고 E. faecalis는 연구기간동안 검출되지 않았다. 동정된 VRE는 모두 vanA를 가지고 있었고 DNA와 plasmid에서 동시에 가지고 있었다. 표현형이 VanB이지만 vanA을 가지고 있는 vanB-phenotype vanA genotype도 동정되었다. VRE는 표준균주에 비해 다약제내성을 가지고 있었고 B-lactam계의 항생제들과 Imipenem은 모두 내성을 보였다. Chloramphenicol, Tetracycline과 Streptomycin 2000은 대부분 감수성을 보였고 세균의 리보솜에 작용하여 필수단백질 합성을 저해하는 Quinupristin/Dalfopristin과 Linezolid에는 모두 감수성을 보였다. Enterococcus의 species에 따른 항생제 연관성은 없었다. VRE로 동정된 E. faecium과 E. gallinarum을 자연계대배양시 van유전자는 지속성을 보였고 E. gallinarum에서는 감소하였으나 항생제에 의해 다시 회복 되었다. 표준균주가 vancomycin이 함유된 배양에서 걸리는 시간은 E. faecium이 E. faecalis보다 빨리 자랐고 van유전자의 획득 없이도 vancomycin에 내성 또는 중간내성을 보였다.
결론 : 임상에서 자주 분리되는 VRE의 검체는 stool이고 vanA를 가지고 있다. Vancomycin 내성유전자 획득은 자연환경에 의해 이루어지는 것은 아니라 항생제 내성유전자의 전이에 의해 이루어지고 있으며 vancomycin 환경에 따라 vancomycin에 내성이나 중간내성을 보이기도 한다. 특히 E. faecium이 E. faecalis에 비해 항생제 존재 하에 생존 및 항생제 내성유전자 전이가 용이한 것으로 판단된다. 최근 보고된 VRE는 다약제내성을 보이고 있으며 다양한 van gene casette을 구성하고 있으나 아직 어떤 유전자의 변이에 의해 다약제내성이 나타나는지에 대한 연구가 필요하다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Vancomycin-resistant Enterococcus spp (VRE) were isolated from clinic stools, analyzed antibiotics resistant profiles and van gene cassette to determine antibiotics phenotype and genotype. Interactions between insertion of IS1216V and IS1542 genes and antibiotics susceptibility to teicoplanin were compared. Consistence of van gene in VRE cultured in broth without vancomycin by serial passage was determined. Growth time and antibiotics susceptibility of reference strains passaged in broth with different concentration of vancomycin were studied. Finally, gene transfer of van gene from VRE to reference strains(E. faecium and E. faecalis) and two types of Stapylococcus aureus(MSSA and MRSA).
VRE strains isolated from stools were E. faecium and E. gallinarum but not E. faecalis. There were 10 VanA and 1 VanB phenotypes among 11 VRE isolates which were classified as vanA genotype with only vanA gene. vanA gene was detected on both of chromosome and plasmid from all of isolates. Isolated VRE showed multi-drug resistant to antibiotics with β-lactamase and imipenem, but sensitive to quinupristin/dalfopristin. There was no relationship between Enterococcus species and multi-drug resistant. IS1216 gene in VRE showing sensitive intermediate to teicoplanin was not detected or weakly detected. Copy numbers of vanA were decreased in E. gallinarum cultured in broth without antibiotics but not in E. faecium. Copy numbers of vanA were recovered in condition of vancomycin. Growth time of reference E. faecium is faster than that of reference E. faecalis in broth with vancomycin. Reference strains cultured in broth with vancomycin showed antibiotics resistant or intermediate without acquisition of van genes.
Gene transfer of van gene from VRE to reference strains and two types of Stapylococcus aureus was failed by agar mating, broth mating and filter mating.

목차 (Table of Contents)

• I. 서 론 1
• 1. 연구 배경 1
• 2. 연구 목적 6
• II. 연구 재료 및 방법 9
• 1. 연구 대상 9
• 2. 연구 방법 9
• 1) Genomic DNA 추출 9
• 2) Plasmid 추출 10
• 3) PCR 10
• 4) 무항생제 배지에서 VRE 계대에 의한 항생제 감수성변화 11
• 5) 항생제 첨가배지에서 계대에 의한 내성획득 유도시험 11
• 6) 항생제 감수성 시험 12
• 7) Mating을 이용한 유전자 전이 시험 12
• 7-1. Liquid mating (1:4) 12
• 7-2. Solid mating (1:1) 13
• 7-3. Filter mating (1:10) 13
• Ⅲ. 연구 결과 14
• 1. VRE 유행형 균주 14
• 2. VRE의 항생제 phenotype과 genotype 14
• 3. VRE의 다약제내성 Pattern 15
• 4. VRE의 chromosomal DNA와 plasmid vanA유전자 검출 17
• 5. IS1216V와 IS1542와 Teicoplanin의 항생제 감수성 비교 19
• 6. 계대배양을 통한 VRE 유전자의 지속성 22
• 7. 저농도 vancomycin존재 하에서 Enterococcus spp의 성장속도 변화 24
• 8. 중등도 vancomycin존재 하에서 Enterococcus spp의 성장속도 변화 25
• 9. Vancomycin 농도에 따른 표준 Enterococcus spp의 항생제 감수성 변화 26
• Ⅳ. 고찰 33
• V. 결론 37