Decapping activators Edc3 and Scd6 play an overlapping role in Ste12 expression and P-body formation

국문 초록 (Abstract)

Decapping 활성화 단백질인 Edc3와 Scd6의 Ste12발현과 P-body형성에 있어서 협동적인 조절 기능 연구

이 수 용


충남대학교 대학원 생명과학과 분자미생물 및 생명공학 전공
(지도교수 김 진 미)

다양한 세포 상태나 환경 스트레스에 의하여 mRNA의 효율적인 번역 또는 분해가 조절 될 수 있다. 특히 이러한 번역과 분해는 서로 경쟁적으로 작용한다. 일반적으로 스트레스 조건하에서는 P-body를 형성하여 mRNA decay complex가 형성이 되어 mRNA 분해가 일어난다. 하지만 환경조건이 바뀌면 mRNA decay complex가 형성이 되더라도 필수적으로 mRNA 분해과정을 거치지 않는다. 이렇게 mRNA decay complex가 번역 조절 기작을 확인하는데 중요하다. mRNA decay complex의 구성요소들은 decapping enzyme인 Dcp1/Dcp2, exonuclease인 Xrn1, decapping activator인 Dhh1, Pat1, Lsm1-7복합체 Edc3, Scd6가 존재한다.
이중 나는 Edc3와 Scd6에 초점을 맞추어서 연구를 진행하였다. Edc3와 Scd6는 공통 domain인 FDF과 Lsm domain을 공유하고 있다. FDF과 Lsm domain은 각각의 기능을 가지고 있다. 하지만 Edc3와 Scd6 중 한 개만 결손된 균주에서는 기능의 결함이 없지만 두개의 유전자가 같이 결손된 균주에서는 기능의 결함이 생길 수 있다. 대표적으로는 두개의 유전자가 같이 결손된 균주에서 mRNA 의 안정성이 확연하게 증가하는 선행연구 결과가 있다. 나는 이것에 착안하여 두개의 유전자가 같이 작용하여 번역 조절 기작에 어떻게 영향을 미치는지 Ste12발현량과 P-body형성을 통해 확인하였다.
먼저 edc3, scd6 결손 균주와 edc3scd6 가 같이 결손된 균주를 바탕으로 실험을 진행하였다. Phenotype으로 대표적으로 볼 수 있는 cell growth와 cell morphology를 확인하였다. 야생형균주와 비교했을 때 edc3, scd6가 단일로 결손된 균주에서는 cell growth와 cell morphology의 차이가 나타나지 않았다. 하지만 edc3scd6 같이 결손된 균주에서는 cell growth에 느려지는 결함이 발생하였고 cell morphology도 야생형균주와 다르게 부풀어서 커지는 것을 관찰할 수 있었다. 이것으로 보아 Edc3와 Scd6 각각의 단백질은 Phenotypes에 영향을 미치지 않는 것처럼 보이지만 두개의 단백질이 같이 작용하면 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었다.
한편 Edc3와 Scd6의 번역조절기작을 관찰하기 위해 Ste12발현과 P-body형성을 확인하였다. Ste12발현에 있어서 각각의 유전자가 Ste12에 발현량에 영향이 없는 것으로 확인하였다. 하지만 이중 결손 균주에서는 Ste12의 발현량이 눈에띄게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 P-body형성에 있어서는 Edc3와 Scd6는 P-body의 구성요소 이기 때문에 단일 결손 균주에서는 P-body의 형성이 감소하였다. 하지만 이중 결손 균주에서는 P-body의 형성이 감소하는 것을 넘어서 거의 찾아볼 수 없었다. 결과적으로 Edc3와 Scd6는 협동적으로 여러 기능에 영향을 미치는데 Ste12발현 조절에 있어서 positive하게 작용을 하고 P-body형성에 중요한 영향을 미친다고 결론을 내릴 수 있다. 한편 Scd6의 domain들 중 RGG domain이 있는데 이domain의 메틸레이션이 핵심 기능인 eIF4G에 결합하는데 영향을 미친다고 알려져 있다. 나는 RGG domain이 Ste12의 발현과 P-body형성에 어떤 영향을 미치는지 연구를 하였다. 결과적으로 RGG domain의 메틸레이션이 Ste12의 발현에 있어서 positive한 조절을 하고 P-body형성에 영향을 미친다고 결론을 내릴 수 있었다.
더 나아가서 다른 decapping activator인 Dhh1과 Scd6의 기능적 상호작용에 대해서 연구하였다. dhh1이 결손된 균주에서는 Ste12의 발현량이 크게 감소하였고 scd6가 결손된 균주에서는 Ste12 발현량에 크게 영향이 없었다. dhh1scd6가 같이 결손된 균주에서는 dhh1 단일 결손 균주에서처럼 Ste12이 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이것으로 보아 두개의 단백질의 상호작용에 있어서 Scd6가 Dhh1보다 상위 단계에서 작용한다고 볼 수 있다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction
• 2. Materials and Methods
• 2.1. Strains, Media and cell culture conditions
• 2.2. Construction of double deletion strain
• 2.3. Construction of SCD6 arginine methylation site deletion
• 2.4. Western blot analysis
• 2.5. Spotting assay
• 2.6. Preparation of cells P-body formation for microscopy
• 3. Results and discussions
• 3.1. The edc3scd6 double mutation cooperatively affected the growth phenotypes.
• 3.2. The edc3scd6 double cooperatively affected P-body formation.
• 3.3. The edc3scd6 double mutation cooperatively affected the Ste12 expression.
• 3.4. RGG domain of Scd6 affected the Ste12 expression and P-body formation.
• 3.5. Scd6 works on as a higher level of translation regulation mechanism than Dhh1.
• 4. Conclusion
• 5. References
• ABSTRACT
• 감사의 글