제대혈 조혈모세포의 체외확장에 냉동보존이 미치는 영향 = The Effect of Cryopreservation on ex vivo Expansion Potential of Umbilical Cord Blood Progenitor Cells

국문 초록 (Abstract)

연구배경: 제대혈 조혈모세포이식술은 많은 장점이 있지만 채혈할 수 있는 제대혈액의 양에 제한이 있어 아직 성인에서는 시행되지 못하고 있다. 이런 문제점을 극복하기 위해서는 냉동보존된 제대혈 조혈모세포를 해동한 후 체외확장을 통한 세포수의 증가가 필요하다. 이에 저자는 냉동보존 전후의 제대혈액의 단핵세포수, 세포생존율 및 세포 집락 형성능을 비교하여 제대혈 조혈모세포의 세포생존율과 체외확장에 냉동보존이 어떤 영향을 미치는지를 알아보기 위해서 본 연구를 시행하였다.
방법: 정상 산모에서 질식분만 후 제대에서 20 mL의 제대혈액을 채집하여 단핵세포를 분리하고 냉동보전 전후에 제대혈 단핵세포의 세포생존율을 계산하여 비교하였다. 냉동보존을 하지 않은 상태의 제대혈 단핵세포와 7일간 또는 28일간 냉동보존을 한 후 해동한 제대혈 단핵세포를 각각 성장인자가 첨가된 배지에서 2×10^(6)/mL개의 단핵세포를 섞은 뒤 35 mm Petri dish 에서 37℃, 100% 습윤, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 14일간 배양한 후 세포 집락수와 모양을 관찰하고 냉동보존 전후의 세포 집락 형성능을 비교하였다.
결과: 6예의 산모에서 제대혈액을 채집하여 측정한 제대혈 단핵세포 수는 냉동보존 하기 전이 2.92±1.08×10^(6)/mL개였고 7일간 냉동보존 한 경우와 28일간 냉동보존을 한 경우는 각각 1.15±0.36×10^(6)/mL개와 1.42±0.42×10^(6)/mL개였다. 제대혈 단핵세포의 세포생존율은 냉동보존을 하지 않은 경우가 92±2.88%였고 7일간 냉동보존한 경우와 28일간 냉동보존을 한 경우는 각각 61±3.84%와 66±3.87%로 냉동보존이 세포생존율은 감소시키지만 냉동보존의 기간에 따른 세포생존율에는 큰 차이가 없었다(P=0.064). 제대혈 단핵세포의 집락수와 세포 집락 형성능은 냉동보존을 하지 않고 배양한 경우 총 집락수는 101.5±23.74였고 그중 CFU-GM 28.8±2.04 (29.5±5.80%), CFU-GEMM 21.5±5.79 (21.0±1.45%), BFU-E 24.8±5.00 (24.8±5.0%)였으며 CFU-G와 CFU-M을 제외한 집락수에서 CFU-GM, CFU-GEMM, BFU- E가 차지하는 비율은 각각 39.0±4.57%, 28.2±3.59%, 32.9±1.47%였고, 28일간 냉동보존을 한 후 해동하여 배양한 경우에는 총 집락수는 52.5±12.13이었으며 이 중 CFU-GM 14.6±2.73, CFU-GEMM 13.7±1.21, BFU-E 23.5±5.01이었으며 CFU-G와 CFU-M을 제외한 집락수에서 CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E가 차지하는 비율은 각각 28.2±2.13%, 26.7±3.00%, 45.1±3.55%로 냉동보존을 한 경우 집락수는 감소하였지만 세포 집락 형성능의 감소는 없었다.
결론: 냉동보존 자체가 제대혈 조혈모세포의 세포생존율은 감소시키지만 세포 집락 형성능에는 영향을 거의 주지 않으므로 냉동보존 후 제대혈 조혈모세포의 체외확장을 통해 성인에서도 성공적으로 제대혈 조혈모세포이식술을 시행할 수 있을 것이라고 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: Umbilical cord blood stem cell transplantation has many advantages over bone marrow transplantation or peripheral blood stem cell transplantation. But, there are some problems to be solved in order to be applied to adults. The main problem is limitation of volume, which can be collected from one placenta was only between 80 mL and 120 mL. To overcome this problem, The ex vivo expansion of cryopreserved umbilical cord blood stem cells is needed. The object of this study was to evaluate the effect of cryopreservation on ex vivo expansion potential and viability of umbilical cord blood stem cells.
Methods: After normal delivery, cord blood was drawn from umbilical cord vein and was used to evaluate the mononuclear cell count, the cell viability and clonogenic capacity of cord blood stem cells before and after cryopreservation.
Results: Before cryopreservation, the mononuclear cell count of umbilical cord blood was 2.92±1.08×10^(6)/mL, cell viability was 92±2.88%, total colony count was 101.5±23.74 and percentages of CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E were 29.5±5.80%, 21.0±1.45%, 24.8±5.0%, respectively. The mononu-clear cell count of umbilical cord blood cryopreserved for 28 days was 1.42±0.42×10^(6)/mL and cell viability was 66±3.87%. Total colony count of umbilical cord blood cryopreserved for 28 days was 52.5±12.13 and percentages of CFU-GM, CFU- GEMM, BFU-E were 28.0±3.45%, 27.2±6.52%, 45.3±4.99%. But, There were few colony count which could be observed after cryopreserving for 7 days.
Conclusion: There was no difference of clonogenic capacity of umbilical cord blood stem cells before and after cryopreservation. The cell viability of umbilical cord blood stem cells was decreased after cryopreservation but there was no difference between umbilical cord blood cryopreserved for 7 days and 28 days. Therefore, it is possible that sufficient umbilical cord blood stem cells could be obtained by ex vivo expansion of cryopreserved umbilical cord blood in order to be used for adult patient.