Anti-adipogenic and Anti-inflammatory effect of Dibenzoylmethane in 3T3-L1 and RAW264.7

국문 초록 (Abstract)

식물에서 유래되는 피토케미칼들은 다양한 생리활성을 가지고 있으며 그에 대한 연구가 증가하고 있다. 본 연구에서는 식물유래 피토케미칼의 한 종류인 Dibenzoylmethane (1,3-Diphenyl-1,3-propanedione, DBM)의 의 지방축적과 염증반응에 대한 효과를 지방세포와 마크로파지 세포를 이용하여 연구 하였다. DBM은 커큐민 (curcumin)의 유도체로서 주로 감초뿌리 (licorice root)에 함유 되어 있다. 많은 연구에 따르면, DBM은 항염증, 항암, 세포주기 조절, 항 노화 그리고 항 에스트로겐 활성 등 다양한 생리활성 기능을 가지고 있는 것으로 알려지고 있다. 하지만 지방세포에서 지방축적와 산화스트레스에 미치는 영향 및 마크로파지에서 염증반응에 대한 효과 등은 아직 체계적으로 이루어지지 않고 있다. 따라서 이 논문에서는 DBM의 지방축적과 산화스트레스에 대한 효과를 3T3-L1 cell에서 확인하고자 하였으며, LPS에 의해 활성화된 Raw 264.7 cell에서 염증반응들에 대한 효과를 확인하고자 하였다.
Oil-red O 염색법을 통해 DBM이 3T3-L1의 지방분화가 진행되는 과정에서 지방축적을 효과적으로 억제하는 것이 관찰되었다. 이러한 지방축적에 대한 억제효과는 지방분화 및 축적을 주관하는 것으로 알려진 CCAAT-enhancer-binding protein-α(C/EBPα), peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ)의 전사인자들과 이들의 타겟 유전자인 fatty acid-binding protein 4 (FABP4)을 포함하는 지방분화인자들의 발현 감소 때문인 것으로 확인되었다. 또한, 지방분화시기별 DBM의 저해양상을 분석한 결과 DBM은 일반적으로 초기 지방 분화단계 (day 0-2)에서 지방축적을 억제하는 것으로 관찰되어지는데, 이러한 효과는 초기 지바분화인자들인 CCAAT-enhancer-binding protein-β (C/EBPβ), C/EBPδ, Krueppel-like factor (KLF) 2의 조절을 통해서 이루어지는 것으로 관찰되었다. 한편, 세포 내 ROS 형성에 대한 DBM의 효과를 측정한 결과 DBM가 세포내 ROS형성을 효과적으로 감소하는 것이 Nitro blue Tetrazolium (NBT)와 Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assays를 통해서 확인 되었다. 따라서 항산화 관련 신호전달체계중의 하나인 nuclear transcription factor E2-related factor-2 (Nrf2)/Kelch-like ECH-associated protein (keap1) 경로 (Nrf2-keap1 pathway)에 대한 DBM의 효과를 분석한 결과 DBM이 Nrf2-keap1경로를 조절하는 것으로 관찰되었다. 실험 결과 DBM은 Nrf2의 단백질 발현을 효과적으로 증가시켰으며, Nrf2의 타겟 유전자인 hemoxygenase-1(HO-1)의 단백질 수준을 증가시켰다. DBM에 의한 HO-1의 발현증가는 DBM에의해 Nrf2의 핵으로의 이동이 증가하기 때문인 것으로 관찰되었다.
DBM의 염증반응에 대한 효과를 보기 위해 lipopolysaccharide (LPS)로 활성화 된 RAW264.7 cell에서 염증인자들에 대한 효과를 분석하였다. DBM은 LPS에 의해서 유도된 Nitric oxide (NO)의 과도한 생성을 유의적으로 감소시켰다. 이러한 결과는 NO의 생성을 주관하는 효소인 Inducible NO synthase (iNOS)의 발현이 DBM에 의해 감소하기 때문인 것으로 관찰되었다. 또 다른 대표적 염증성 인자인 cyclooxygenase-2 (COX2)의 발현도 DBM에 의해 억제되었다. 더 나아가 이들 염증인자들과 싸이토카인들의 발현을 주관하는 전사인자인 Nuclear Factor-κB (NF-κB)와 관련 조절 분자인 IκBα에 대한 DBM의 영향을 분석한 결과 DBM은 IκBα의 인산화를 억제하여 활성을 저해하였고 NF-kB의 핵으로 이동도 DBM에 의해 억제되었다. 이러한 결과는 DBM에 의한 IκBα의 활성억제를 통해 NF-κB의 핵으로의 이동을 억제하는 것으로 사료되며 DBM에 의해서 NF-κB이 핵 이동이 억제됨으로 인해서 NF-κB에 의해서 조절되는 COX2를 비롯한 여러 염증인자들의 발현이 억제되는 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• 1.1. Phytochemicals and dibenzoylmethane (DBM) 1
• 1.2. Adipogenesis 2
• 1.3. Inflammation 3
• 1.4. Obesity, oxidative stress, and inflammation 5
• 1.5. Nrf2-keap1 pathway 6
• 1.6. Aim of the study 8
• PartⅠ. Anti-adipogenic effect of Dibenzoylmethane in 3T3-L1 cell.
• Ⅱ. Materials and Method 12
• 2.1. Chemicals 12
• 2.2. Cell cultures 12
• 2.3. MTT assay 13
• 2.4. Determination of lipid accumulation 13
• 2.5. Production of ROS in cells using 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) and nitroblue tetrazolium (NBT) assay 13
• 2.6. Western blot assay 14
• 2.7. Separation of cytosol and nuclear frationation 15
• 2.8. Real-Time PCR 15
• 2.9. Statistical analysis 16
• Ⅲ. Result and Discussion 17
• 3.1. Effect of Dibenzoylmethane (DBM) on cell viability. 17
• 3.2. Effect of Dibenzoylmethane (DBM) on fat accumulating during adipocyte differentiation. 17
• 3.3. Effect of Dibenzoylmethane (DBM) on adipogenic stages. 22
• 3.4. Effect of Dibenzoylmethane (DBM) on ROS production. 27
• 3.5. Effect of Dibenzoylmethane (DBM) on Nrf2 and HO-1. 31
• 3.6. Changes in nucleus level of Nrf2. 34
• 3.7. Effect of Dibenzoylmethane (DBM) on resistin, adiponectin and visfatin. 37
• PartⅡ. Anti-inflammatory effect of Dibenzoylmethane in RAW 264.7 cell.
• Ⅳ. Materials and Method 42
• 4.1. Chemicals 42
• 4.2. Cell cultures 42
• 4.3. MTT assay 42
• 4.4. NO assay 43
• 4.5. Western blot assay 43
• 4.6. Separation of cytosol and nuclear frationation 44
• 4.7. Statistical analysis 44
• Ⅴ. Result and Discussion 45
• 5.1. Effect of Dibenzoylmethane (DBM) on the viability of the cell.
• 45
• 5.2. Effects of DBM on nitric oxide(NO) production of LPS-activated RAW264.7 cells. 45
• 5.3. Changes in COX2 and iNOS expression. 49
• 5.4. Effect of Dibenzoylmethane (DBM) on IκBα and NF-κB p65 expression 52
• Reference 58
• 초 록 73