임상적용 가능한 X-연관 부신백질이영양증 특이적 인간 역분화 줄기세포 확립 및 효율적 세포치료법 개발과 기전 연구 시스템 구축 = Establishment of clinically applicable X linked adrenoleukodystrophy patient specific reprogrammed stem cells

국문 초록 (Abstract)

Ⅰ. 연구개발의 목적 및 필요성
- X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD)는 동물 모델이 없어 병리기전 연구가 여려워 적당한 치료약이 없으므로 환자의 상피 세포로부터 역분화 줄기세포를 확립하여 약물 개발 및 병리 기전 연구를 위한 기초 기반 기술을 제공하는 것을 목표로 함.
- 치명적인 소아기 대뇌형의 부신백질이영양증의 대부분 환아가 신경학적 증상이 발현된 후 궁극 적회복을 위해 세포치료가 요구되므로 유전자 재조합으로 ABCD1이 교정되고 비유전적인 방법으로 임상적용 수준의 환자 맞춤형 역분화 줄기세포의 수립은 이러한 문제를 해결할 수 있는 가장 적합한 기술 이라고 사료됨.
- X-ALD 역분화 줄기세포를 신경 전구세포로 분화하여, polysialylated(PSA)형 신경세포 부착분자(neural cell adhesion molecule+, NCAM+) 양성 세포 혹은 A2B5 양성 전구세포만을 선별적으로 순수분리 후 희소돌기 교세포(oligodendrocyte)로 분화 및 대량 확보하여 동물모델에서 이식 치료 가능성 검증.
Ⅱ. 연구개발의 내용 및 범위
- X-ALD 환자의 상피세포에서 ABCD1 유전자를 유전자 재조합으로 교정.
- 비유전적인 방법으로 임상 적용 가능성을 높인 질병/환자 특이적 역분화 줄기세포주 확립.
- 수립된 역분화 줄기세포를 고수율의 신경전구세포로 분화 후, PSA-NCAM 양성 세포(희소돌기교세포로의 분화와 이식 후 이동능이 높음), 혹은 A2B5 양성 전구세포(희소돌기교세포의 초기분화마커)의 선별적 분리 및 대량 증식법과 분화기술법 개발.
- X-ALD 역분화 줄기세포로부터 분화된 희소돌기교세포에서 T3 및 관련 drug 처리를 통한 ABCD2 발현 증가를 유도하여 긴꼬리지방산 (very long chain fatty acid) 분해능 향상에 기여함을 확인.
- T3 및 관련 drug의 처리에 의해 자격화된 PSA-NCAM 양성 세포를 수초 결손 동물 모델 (Shiverer쥐)의 뇌신경계에 이식 후 세포 생착능, 희소돌기교세포로의 분화능, 수초 형성능 확인하고, 궁극적으로 신경행동 향상 평가
Ⅲ. 연구개발결과
- 두 타입의 X-ALD 환자(CCALD와 AMN)의 상피세포로부터 역분화 줄기세포주 각각 확립.
- PSA-NCAM 및 A2B5 양성 세포 순수분리 후 희소돌기교세포로의 효율적인 분화법 개발.
- X-ALD 역분화 줄기세포로부터 분화된 올리고덴드로사이트를 이용하여 4-PBA와 lovastatin 으로 자격화 검증.
- ABCD1 유전자 변이를 교정하기 위한 정상 ABCD1을 발현하는 lentivirus 확립.
- 새로운 약물을 찾는 스크리닝 시스템 구축.
Ⅳ. 연구개발결과의 활용계획
- 역분화 줄기세포는 기전 연구와 신약개발에 대한 강력한 모델 제공과 임상전 독성 테스트 및 세포 이식 치료의 검증 단계를 제공하여 획기적으로 비용절감과 안전성에 기여할 것임.
- 나아가 환자 맞춤형 줄기세포를 통해 맞춤형 치료 방법까지 제시해 줄 수 있을 것이라 사료됨.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Purpose
- At present, no satisfactory therapy for X-ALD is available. ABCD1 knockout mouse model does not mirror the clinical and pathological abnormalities of a fetal type of human X-ALD, CCALD. Our main goal is to establish disease- and patient-specific reprogrammed cells from this disease that are rare and known to be incurable. Establishment of iPSC technology will lead us in providing platforms for addressing mechanisms of diseases and in development of new drugs.
- Our aims to generate the non-viral gene transfer method and ABCD1 correction system for cell therapy in the near future.
- Functional confirmation of iPS-derived oligodendrocyte precursor cells by cell-transplantation into animal models in order to identify their therapeutic potential.
Contents
- Establishment of iPS cells from X-ALD patients by using 4 reprogramming factors.
- Generation unharmful iPS cells by utilizing non-viral and non-integrating techniques after correction of defect ABCD1 by zinc finger nuclease or lentivirus expressing the ABCD1 gene.
- Development of purification method of PSA-NCAM+or A2B5+ cells and advancement of oligodendrocyte differentiation protocol from PSA-NCAM+or A2B5+ cells.
- Validating the effect of drugs in the X-ALD oligodendrocytes
- Development of mass culture conditions of oligodendrocyte precursor cells which are derived from iPS technology, in order to address mechanisms of diseases and to develop new drug treatments.
- Functional confirmation of iPS-derived oligodendrocyte precursor cells by cell-transplantation into animal models.
Results
- Establishment of iPS cells from patients with two major subtypes of x-linked adrenoleukodystrophy by using 4 reprogramming factors.
- Development of purification method of PSA-NCAM+or A2B5+ cells and oligodendrocyte differentiation protocol from PSA-NCAM+or A2B5+ cells.
- Validating the effect of lovastatin or 4-phenylbutyrate reducing the abnormal accumulation of VLCFA in the X-ALD oligodendrocytes by the upregulated ABCD2 gene expression.
- Generation of lentivirus system expressing the ABCD1 gene to correct ABCD1 deficient in X-ALD patient.
- X-ALD iPSC-based screening system provides a useful platform to evaluate the therapeutic efficacy of new drugs
Expected Contribution
- X-ALD cell model system would allow us a systematic examination of subtype-specific mechanisms for etiopathophysiology of X-ALD and development of new effective therapeutics
- Following the functional confirmation, cellular models of diseases would be developed and optimized for mechanism studies of disease, drug screening, and for pre-clinical toxicity tests.