Itraconazole ameliorates chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis in mice

국문 초록 (Abstract)

목적: 복막경화증은 복막투석환자에서 투석의 실패 및 높은 사망률과 연관된 심각한 합병증 중 하나이다. 하지만 아직 명확한 메커니즘이 밝혀지지 않았고 질병 특이적인 치료 방법이 확립되어 있지 않아 추가 연구가 필요한 분야이다. 최근 Sonic hedgehog (Shh) 신호전달체계가 조직의 섬유화에 관여하고 있다는 것이 보고 되었으며, 이 신호전달체계를 억제하는 약물이 항섬유화 치료 분야에서 각광을 받고 있다. 항진균제로 널리 알려져 있는 이트라코나졸 (itraconazole) 또한 Shh 신호전달체계를 억제하는 효과를 가지는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 Shh 신호전달체계가 복막경화증의 발생에 관여하는지와 이트라코나졸 이 복막경화증에 어떠한 효과를 가지는지에 대해 복막경화증 마우스모델과 인간복막중피세포 (human peritoneal mesothelial cells)를 사용하여 연구하였다.
방법: 동물실험에는 C57BL/6 마우스가 사용되었으며, 복막경화는 0.1 % 클로로헥시딘 글루코네이트 (chlorhexidine gluconate, CG)를 격일로 4주 동안 복강 내 주사하여 유발되었다. 치료그룹은 매일 itraconazole 20mg/Kg을 복강 내 주사하였고, 대조그룹은 식염수 (saline)를 복강내 주사하였다. 동물들은 총 4개의 그룹으로 나뉘어 졌으며 (saline 그룹, saline + itraconazole 그룹, CG 그룹, CG + itraconazole 그룹), 복막의 조직학적 변화와 복막 내 Shh 신호전달체계의 발현, 경화증 관련 인자들의 발현을 관찰하였다. 세포실험은 인간복막중피세포를 사용하여 진행되었다. 세포들은 이트라코나졸의 부재 혹은 존재 하에 Shh 단백질과 함께 배양되었으며, 세포의 형태학적 변화와 Shh 신호전달체계의 중요 요소 발현을 관찰하였다.
결과: CG로 복막경화를 유도한 그룹에서 유의한 복막두께의 증가가 관찰되었으며 (80.4 ± 35.6 µm), itraconazole 치료는 복막두께를 유의하게 감소시켰다 (28.2 ± 20.6 µm, p < 0.001). Shh 신호전달체계의 중요 요소인 Shh, patched (PTCH), smoothened (SMO), glioma-associated oncogene transcription factor 1 (GLI1)의 유전자 발현은 CG 그룹의 복막조직에서 상승하였다가 CG + Itraconazole 그룹의 복막조직에서는 유의하게 감소함이 확인 되었다. CG의 복강 내 투여는 α-smooth muscle actin, type I collagen, transforming growth factor-β1과 같은 경화증 관련 인자의 발현을 증가시켰으며, 이트라코나졸 치료는 이를 억제시켰다. 인간복막중피세포에서는 Shh 단백질의 자극으로 SMO와 GLI1의 발현이 증가하였으며, 이는 동물모델에서의 결과와 유사하게 이트라코나졸 치료로 유의하게 감소함이 확인되었다.
결론: 본 연구는 Shh 신호전달체계가 복막경화증의 발생에 관여함을 확인한 첫 번째 연구로, 이트라코나졸 치료가 Shh 신호전달을 조절하여 복막경화증에 대하여 보호효과를 가진다는 것을 같이 확인하였다. 이러한 결과들은 Shh 신호전달체계의 억제가 복막경화증의 잠재적 치료 방안이 될 수 있음을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background
Peritoneal fibrosis is a devastating complication of peritoneal dialysis (PD), and one of the important causes which lead to discontinuation of PD. However, the precise mechanism is unclear and specific treatment has not yet been established. Recent evidence suggests that Sonic hedgehog (Shh) signaling pathway is involved in tissue fibrogenesis, and drugs which inhibit this pathway are emerging in the field of anti-fibrosis therapy. Itraconazole, an anti-fungal agent, is recently also recognized as an inhibitor of Shh signaling pathway. The present study investigated whether Shh signaling pathway was involved in the development of peritoneal fibrosis, and examined the effects of itraconazole on peritoneal fibrosis using a mouse model and human peritoneal mesothelial cells (HPMCs).
Methods
Male C57BL/6 mice were used in this study. Peritoneal fibrosis was induced by intraperitoneal (IP) injection of 0.1% chlorhexidine gluconate (CG) solution every other day for 4 weeks, with or without itraconazole treatment (20mg/kg, IP injection on a daily basis). Isotonic saline was administered intraperitoneally to the control group. The mice were divided into four groups: saline group, saline plus itraconazole group, CG group, and CG plus itraconazole group. Histological changes, expression of fibrosis markers and main components of Shh signaling pathway were evaluated upon peritoneal tissues. In vitro study also performed using HPMCs. The cells were incubated with recombinant human Shh protein in the absence or presence of itraconazole. Morphological changes and components of Shh signaling pathway expression in HPMCs were determined.

Results
Peritoneal thickening was evident in the CG group and was significantly decreased by administration of itraconazole (80.4 ± 35.6 µm vs. 28.2 ± 20.6 µm, p < 0.001). The expression of Shh signaling pathway components including Shh, patched (PTCH), smoothened (SMO), and glioma-associated oncogene transcription factor 1 (GLI1) was upregulated in the CG group and suppressed by itraconazole treatment. Peritoneal injection of CG solution increased the expression of fibrosis markers such as α-smooth muscle actin (α-SMA), type I collagen, and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in peritoneal tissues, and itraconazole treatment significantly decreased these expressions. In HPMCs, recombinant Shh protein activated SMO and GLI1 expression and itraconazole treatment attenuated the Shh protein-mediated induction of SMO and GLI1.
Conclusion
This study provides the first evidence that the Shh signaling pathway is implicated in peritoneal fibrosis. It is also demonstrated that itraconazole treatment has protective effects on peritoneal fibrosis through regulating the Shh signaling. These findings suggest that the blockage of the Shh signaling pathway might be a potential therapeutic strategy for peritoneal fibrosis

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and Methods 4
• Animal model and experimental design 4
• Histological analysis and Immunohistochemistry 4
• Human peritoneal mesothelial cell culture and in vitro study design 5
• RNA extraction and real-time polymerase chain reaction 6
• Western blotting 8
• Statistical analysis 8
• 3. Results 9
• Effects of itraconazole on the peritoneal histological changes 9
• Effects of itraconazole on the expression of fibrosis markers in peritoneal tissues 12
• Activity of Shh signaling pathway in the peritoneal tissues 15
• Effects of itraconazole on HPMCs exposed to Shh protein 18
• 4. Discussion 23
• 5. References 29
• 6. Korean Abstract 35