Effects of lycii radicis cortex on RANKL-induced osteoclast differentiation and activation in RAW 264.7 cells

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Postmenopausal osteoporosis is a major age-related disease. After menopause, estrogen deficiency due to osteoclasts is activated, and excessive osteoclast activity curses osteoporosis. Osteoclasts are multinucleated cells generated from the differentiation of monocyte/macrophage precursor cells such as RAW 264.7 cells. The water extract of Lycii Radicis Cortex (LRC) is the dried root bark of Lycium chinense Mill and is called “Jigolpi” in Korea. Its effects have not previously been tested on osteoclastogenesis and postmenopausal osteoporosis. In this study, the effect of LRC on RANKL-induced osteoclast differentiation was demonstrated using tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) assay and pit formation assay. Moreover, to analyze molecular mechanisms, we determined osteoclastogenesis-related markers such as nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 (NFATc1); c-Fos; receptor activator of NF-B (RANK); TRAP; cathepsin K (CTK); matrix metallopeptidase 9 (MMP-9); calcitonin receptor (CTR) and carbonic anhydrase II (CAII) using RT-PCR and immunoblotting. Additionally, we determined the effect of LRC on ovariectomized rat models. Here, LRC inhibited RANKL-induced osteoclasts differentiation via suppressing osteoclastogenesis-related markers. It also inhibited osteoporosis in ovariectomized-rat models through decreasing bone density loss and trabecular area loss. These results suggest that LRC has a positive effect on menopausal osteoporosis.

국문 초록 (Abstract)

연구배경 및 목적: 본 논문은 여성 갱년기 이후 호르몬의 변화로 인해 유발되는 골다공증에서 地骨皮 물 추출물이 폐경기 골다공증 유사 쥐 모델에 미치는 영향과 파골세포 분화에 미치는 영향에 관하여 연구하였다. 세포 수준에서 파골세포 억제효과와 억제 기전 연구, 그리고 폐경기 유사 쥐 모델에 뼈 밀도와 골 소주 면적 측정 등을 연구하여 地骨皮가 폐경기 골다공증을 억제하는 영향을 연구하는 것을 목표로 하였다.

방법: In vitro 실험에서 地骨皮 물 추출물과 RANKL을 RAW 264.7 cell에 같이 처리하여 파골세포 분화를 유도한 뒤 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 염색을 통하여 地骨皮가 파골세포 분화를 억제하는 영향에 대해 확인하였고, 파골세포의 주 능력인 calcium 분해능력 억제 확인, 또한 파골세포 분화와 관련된 유전자인 nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 (NFATc1), c-Fos, receptor activator of NF-B (RANK), TRAP, cathepsin K (CTK), calcitonin receptor (CTR), matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) 그리고 carbonic anhydrase II (CAII)의 발현을 polymerase chain reaction (PCR) 통하여 유전자의 발현 정도를 측정하였다. 그리고 NFATc1과 c-Fos 는 immunoblotting 을 통하여 단백질 수준에서도 확인하였다. In vivo 실험에서 SD-rat의 난소를 적출하여 폐경기 골다공증 유사 모델을 성립한 뒤 8주 동안 地骨皮 물 추출물을 구강 투여했다. 8주후 SD-rat를 희생하여 대퇴골 조직을 채취하고 무게 측정과 조직학적 검사를 시행하였다.

결과: in vitro에서 地骨皮 물 추출물은 파골세포의 숫자와 활성을 억제하였고, 파골세포의 골 흡수 능력도 억제하였다. 또한 유전자 수준에서, 파골세포 분화와 관련한 유전자인 NFATc1, c-Fos, RANK, TRAP, CTK, CTR, MMP-9 그리고CAII를 전부 억제하였으며, 단백질 수준에서의 NFATc1의 발현과 c-Fos 의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다. in vivo에서 地骨皮 물 추출물은 폐경기 유사 골다공증 유발 SD-rat의 골밀도와 골소주의 면적이 난소를 적출한 대조군에 비해 지골피 투여 군이 유의하게 증가하였다.

결론: 地骨皮는 파골세포 특정 유전자의 발현억제를 통하여 파골세포 분화와 활성을 억제하였고, 폐경기 동물 모델에서도 뼈 손실을 감소시키는 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 地骨皮는 골다공증의 치료 약물로 응용될 수 있을 것으로 생각된다.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION 1
• II. MATERIALS AND METHODS 3
• 2.1. Reagents 3
• 2.2. Sample preparation 3
• 2.3. Cell culture 4
• 2.4. Cell cytotoxicity assay 4
• 2.5. TRAP staining and TRAP activity assay 4
• 2.6. Pit formation assay 5
• 2.7. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis 5
• 2.8. Western blotting analysis 7
• 2.9. Animal model of OVX rats and histopathological examination 7
• 2.10. Measurement of bone density-induced OVX 8
• 2.11. Statistical analysis 8
• III. RESULTS 9
• 3.1. LRC did not show cytotoxicity in RAW 264.7 cell. 9
• 3.2. LRC inhibited osteoclastogenesis in RAW 264.7 cells induced by RANKL. 11
• 3.3. LRC inhibited pit formation. 13
• 3.4. LRC inhibited NFATc1 expression. 15
• 3.5. LRC inhibited c-Fos expression. 17
• 3.6. LRC inhibited expression of osteoclastogenesis-related genes. 19
• 3.7. LRC increased bone density in OVX rat models. 21
• 3.8. LRC had an inhibitory effect on trabecular area loss in OVX rats. 23
• IV. DISCUSSION 25
• V. CONCLUSION 28
• REFERENCES 29
• ABSTRACT 33
• ABSTRACT IN KOREAN 34