Structure, allosteric regulation, and reaction mechanism of glutamate dehydrogenase = 글루탐산 분해효소(glutamate dehydrogenase)의 구조, 알로스테릭 조절, 및 작용기전

국문 초록 (Abstract)

글루탐산 분해효소 (GDH)의 구조 및 분자적 특성을 알아 보기 위하여 다음과 같은 연구들을 수행하였다. 우선 조미료로 많이 이용되고 있으며 Chinese restaurant syndrome을 유발시키는 물질로 잘 알려져 있는 글루탐산나트륨 (MSG)이 뇌조직 내의 GDH에 미치는 영향을 조사하였다. 장기간 MSG 복용에 의한 뇌에 미치는 영향을 알아보기 위해, 1주된 albino 쥐에게 1년간 식수에 MSG를 첨가하여 먹인 그룹과 먹이지 않은 두 그룹으로 나뉘어 실험해 보았다. 쥐의 몸무게와 뇌의 무게, 총 DNA와 RNA양 그리고 단백질 양에는 두 그룹간의 유의한 차이를 보이지 않았으나 뇌의 생 추출물속의 글루탐산 농도를 비교한 결과, MSG를 먹인 그룹에서는 대조군에 비해 2배 정도 높게 나타났다. 또한, 글루탐산 분해효소(GDH)의 mRNA 양은 두 그룹간의 유의한 차이를 보이지 않았으나, western blot 검사를 실시한 결과 효소의 양은 MSG를 먹인 그룹이 현저해 감소한 것으로 보아, GDH 발현에 있어 후전사 조절에 영향을 미치거나 GDH의 분해율을 증가시키는 것으로 보여진다. 이 결과로, 장기간 MSG를 섭취하게 되면 쥐 뇌 속에 존재하는 GDH 활성을 감소시킴으로 글루탐산의 분해가 저하됨을 알 수 있었다.
다음으로, GDH의 구조적, 기능적 조절형태를 심도 있게 연구하기 위해 1557-base-pair의 인간 GDH 유전자를 합성하여 대장균주를 이용해 활성을 지닌 효소로 발현시켰다. 이렇게 발현된 효소는 사람과 소의 조직에서 추출한 효소와 여러 가지 생화학적 측면에서 유사한 양상을 보였다. 자리지정 돌연변이방법을 이용해 이 효소의 Lys130 위치를 다른 아미노산으로 바꾼 돌연체를 이용해 실험해 본 결과, Lys130 위치는 GDH의 기질이나 다른 조효소가 결합하는 곳이 아닌 촉매작용을 일으키는데 관여하는 중요한 곳임을 알게 되었다.
다음으로, 인간 GDH의 알로스테릭 활성제인 ADP와 조효소인 NAD^(+) 결합부위를 규명하기 위해, 각각 이에 해당되는 Tyr187과 Glu279부위에 대해 돌연변이를 일으켜 아미노산의 크기와 소수성, 곁가지의 이온화 정도에 따라 다양한 돌연체들을 만들어 실험해 보았다. GDH의 자연형은 ADP와 반응시키면 3배정도 활성도가 증가된 반면 ADP 결합부위의 각 돌연체 효소들(Tyr187 돌연체)의 활성은 유의한 차를 보이지 않았다. 정지상태의 역학치수를 구한 결과 Tyr187 돌연체 효소들은, 2-oxoglutarate와 NADH에 대한 K_(m) 값에는 유의한 차이를 보이지 않았으나 V_(max) 값에는 자연형에 비해 4배 정도 감소된 결과를 얻었다. Glu279 돌연체 효소들은 NAD^(+) 와 글루탐산에 대해 V_(max) 값은 22 ∼ 28배 정도 감소한 반면 K_(m) 값은 NAD^(+)에 대해서만 20 ∼ 25배 정도 감소하였다. ADP와 NAD^(+) 결합부위를 규명하기 위해 [α-^(32)P]8-azidoadenosine 5'-diphosphate (8N_(3)ADP)와 [^(32)P]nicotinamide 2-azidoadenosine dinucleotide (2N_(3)NAD^(+))를 이용하여 광흡착표지를 실시한 결과 GDH의 자연형에 대한 [α-^(32)P]8N_(3)ADP와 [^(32)P]2N_(3)NAD^(+)의 광흡착 포화도에 대한 K_(d) 값은 25μM과 55μM로 나타났다. 이때, 자연형의 경우에는 ADP와 NAD^(+)를 첨가하면 8N_(3)ADP와 2N_(3)NAD^(+)의 광흡착이 현저히 감소되었으나, Tyr187와 Glu279 돌연체들은 각각 8N_(3)ADP 및 2N_(3)NAD^(+)와 반응하지 않았다. 즉, 인간 GDH 유전자의 돌연변이와 광흡착표지법을 통해 GDH의 Tyr187과 Glu279 위치는 각각 ADP와 NAD^(+)의 염기가 결합하는 부위임을 증명할 수 있었다.
마지막으로, GDH 결핍으로 신경퇴행성 질환이 생긴 환자에게 부족한 GDH를 단백질 차원에서 보충하기위한 새로운 방법을 시도 하였다. 이를 위해서 인간 GDH 유전자에 인간 면역결핍 바이러스에 존재하는 TAT 단백질의 전이 부위를 융합 시켜 TAT-GDH 융합 단백질을 발현시켰다. 이렇게 얻어진 TAT-GDH 융합 단백질을 변성시켜 신경세포 배양액에 분주한 결과 신경세포 내로 잘 침투하였고, 일단 세포 내로 들어가게 되면 변성된 단백질이 다시 제 형태를 갖추게 되어 정상적인 효소 활성을 가지게 되었다. 즉, TAT 잔기를 GDH에 첨부하여도 GDH 활성에는 별 영향을 미치지 않으며, 세포내 독성도 나타내지 않음을 알게 되었다. 이러한 결과는 GDH 결핍으로 인해 야기된 여러 질환을 앓고있는 환자에게 GDH를 직접 전달할 수 있는 새로운 방법을 제시해 주고 있다고 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Glutamate in the form of its sodium salt (MSG; monosodium glutamate) is a widely used food additive and reported to be a cause of the Chinese restaurant syndrome. To investigate a long-term effect of MSG ingestion on the brain, one-week-old albino rats were kept for 1 year in equal groups with or without MSG in their drinking water. The concentrations of the glutamate in the brain crude extracts of the MSG treated group were 2-fold higher than those of the control group. There were no significant change in body weight, brain weight, and contents of protein, total RNA and DNA in the two groups of rats. The concentration of the enzyme on the western blot analysis was significantly decreased in the MSG treated group, whereas the level of GDH mRNA remained unchanged, suggesting a post-transcriptional control of the expression of GDH or an increased rate of degradation of enzyme protein. These results indicate that the prolonged MSG feeding reduces the activity of GDH and subsequently decreases the catabolism of glutamate in rat brain.
To gain a deeper insight into the structural and regulatory basis of GDH, a 1557-base-pair gene that encodes human GDH has been synthesized and expressed in Escherichia coli as a soluble protein. The recombinant enzymes were indistinguishable in its biochemical properties from those isolated from human and bovine tissues. The results from the site-directed mutagenesis of Lys130 site indicate that Lys130 plays an important role in the catalysis of GDH and that Lys130 is an essential residue required for the catalysis of GDH but not for the substrate or coenzyme binding.
To identify ADP (allosteric activator) and NAD^(+) (coenzyme) binding sites within human GDH, a series of cassette mutations at Tyr187 and Glu279 positions were constructed for ADP and NAD^(+) binding, respectively. The wild type GDH was activated up to 3-fold by ADP, whereas no significant activation by ADP was observed with the Tyr187 mutant GDH regardless of their size, hydrophobicity, and ionization of the side chains. Studies of the steady-state velocity of Tyr187 mutant enzymes revealed essentially unchanged apparent K_(m) values for 2-oxoglutarate and NADH, but an approximately 4-fold decrease in the respective apparent V_(max) values. The Glu279 mutant proteins showed a 22 ∼ 28-fold decrease in the respective apparent V_(max) values and 20 ∼ 25-fold increase in K_m values for NAD^(+) with essentially unchanged K_(m) values for glutamate. The identification of the ADP and NAD^(+) binding sites was further performed using photoaffinity labeling with [α-^(32)P]8-azidoadenosine 5'-diphosphate (8N_(3)ADP) and [^(32)P] nicotinamide 2-azidoadenosine dinucleotide (2N_(3)NAD^(+)). Saturation of photoinsertion with [α-^(32)P]8N_(30ADP and [^(32)P]2N_(3)NAD^(+) occurred apparent K_(d) values near 25 μM and 55 μM, respectively, for wild type GDH. The photoinsertions of 8N_(3)ADP and 2N_(3)NAD^(+) were significantly decreased by ADP and NAD^(+), respectively. Unlike wild type GDH, none of the mutant enzymes at Tyr187 or Glu279 was able to interact with 8N_(3)ADP and 2N_(3)NAD^(+), respectively. The results with cassette mutagenesis and photoaffinity labeling indicate that the Tyr187 and Glu279 are required for efficient base-binding of ADP and NAD^+ to GDH, respectively.
In an effort to replenish the GDH activity in the patients with the GDH deficient neurodegenerative disorders, human GDH was transduced into PC12 cells by fusing with a gene fragment encoding the protein transduction domain of human immunodeficiency virus TAT protein to produce genetic in-frame TAT-GDH fusion protein. The TAT-GDH protein can enter PC12 cells efficiently when added exogenously in culture media. Once inside the cells, the transduced denatured TAT-GDH protein showed a full activity of GDH indicating that the TAT-GDH fusion protein was correctly refolded after delivery into cells and the activities of GDH in the TAT-GDH fusion protein was not affected by the addition of the TAT sequence. TAT-GDH showed no cytotoxicity as determined by the ability to inhibit protein synthesis. These results may suggest new possibilities for direct delivery of GDH into the patients with the GDH-deficient disorders.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS
• LIST OF FIGURES AND TABLES = ix
• ABBREVIATION = xii
• ABSTRACT IN ENGLISH = xiii
• CHAPTER I. Decreased Expression of Glutamate Dehydrogenase by Prolonged Intake of Monosodium Glutamate in Rat Brains = 1
• I. INTRODUCTION = 2
• II. MATERIALS AND METHODS = 6
• Materials = 6
• Enzyme assay and kinetic studies = 6
• Long term effects of monosodium glutamate = 7
• III. RESULTS = 9
• Long term effects of monosodium glutamate feeding = 9
• IV. DISCUSSION = 13
• CHAPTER II. Cassette Mutagenesis of Lysine130 of Human Glutamate Dehydrogenase: An Essential Residue in Catalysis = 18
• I. INTRODUCTION = 19
• II. MATERIALS AND METHODS = 22
• Materials = 22
• Bacterial strains = 22
• Oligonucleotide synthesis = 23
• Design and assembly of the synthetic gene = 23
• Protein purification and characterization = 25
• Enzyme assay and kinetic studies = 27
• Construction and characterization of Lys130 mutants = 28
• Interaction of GDH with PLP and its analogs = 28
• III. RESULTS = 30
• Gene synthesis and expression = 30
• Purification and characterization of the gene product = 31
• Construction of Lys130 mutants = 32
• Interaction of GDH with PLP and its analogs = 33
• IV. DISCUSSION = 45
• CHAPTER III. Cassette Mutagenesis and Photoaffinity Labeling of Adenine Binding Domain of ADP Regulatory Site within Human Glutamate Dehydrogenase = 50
• I. INTRODUCTION = 51
• II. MATERIALS AND METHODS = 56
• Materials = 56
• Bacterial strains = 56
• Construction and characterization of Tyr187 mutants = 57
• Purification and characterization of mutant GDHs = 57
• Enzyme assay and kinetic studies = 59
• Photolabeling of GDH = 60
• Tryptic digestion and isolation of the photolabeled peptide = 61
• III. RESULTS = 64
• Construction and expression of Tyr187 mutants = 64
• Activation of wild type GDH and mutant GDHs by ADP and 8N_(3)ADP = 65
• Saturation and competition of photoinsertion = 66
• Tryptic digestion of photolabeled proteins and isolation of the photolabeled peptide = 67
• Sequence analysis of the photolabeled peptide of GDH = 69
• IV. DISCUSSION = 83
• CHAPTER IV. Site-Directed Mutagenesis and Photoaffinity Labeling of an NAD^(+) Binding Site of Human Glutmate Dehydrogenase = 89
• I. INTRODUCTION = 90
• II. MATERIALS AND METHODS = 95
• Materials = 95
• Bacterial strains = 95
• Construction and characterization of Glu279 mutants = 96
• Purification and characterization of mutant GDHs = 97
• Enzyme assay and kinetic studies = 98
• Photolabeling of GDH = 99
• Tryptic digestion and isolation of photolabeled peptide = 100
• III. RESULTS = 102
• Construction and expression of Glu279 mutant GDHs = 102
• Effects of mucleotides on binding of 2N_(3)NAD^(+) to GDH = 103
• Saturation and competition of photoinsertion = 103
• Tryptic digestion of photolabeled proteins and boronate affinity column = 105
• Sequence analysis of the photolabeled peptide of GDH = 107
• IV. DISCUSSION = 118
• CHAPTER V. TAT-Mediated Delivery of Human Glutamate Dehydrogenase into PC12 Cells = 122
• I. INTRODUCTION = 123
• II. MATERIALS AND METHODS = 127
• Construction of TAT-GDH fusion gene (pTAT-GDH) = 127
• Isolation of TAT-GDH fusion protein = 127
• Cell culture = 128
• Cytotoxicity assay = 129
• Statistical analysis = 130
• III. RESULTS = 131
• Gene synthesis and expression = 131
• Isolation of TAT-GDH fusion protein = 132
• Delivery of TAT-GDH fusion protein into PC12 cells = 132
• IV. DISCUSSION = 139
• CONCLUSIONS = 142
• REFERENCES = 147
• ABSTRACT IN KOREAN = 174