식품유래 병원성세균의 생육을 저해하는, Staphylococcus warneri AW25 유래 Bacteriocin의 특성 조사 = Characterization of a Bacteriocin from Staphylococcus warneri AW25, Inhibiting Growth of Food-borne Pathogenic Bacteria

국문 초록 (Abstract)

김치로부터 박테리오신 생산균주를 분리하여 16S rRNA sequencing 결과 S. warneri AW25로 동정되었다. 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 세포의 모양을 관찰한 결과 구균으로 확인되었으며 M. luteus IAM 1056, L. monocytogenes KCCM 40307, E. faecium KCCM 12118, B. cereus KCCM 11204에 대해 항균활성을 나타내었다. 또한 S. warneri AW25가 식중독의 원인이 되는 장독소 유전자를 가지는지 확인하기 위하여 PCR을 수행한 후 전기영동을 실시한 결과 sea, seh 유전자를 가지고 있음을 확인하였다.
박테리오신 생산을 위한 최적 배양학적 조건은 maltose와 malt extract를 첨가한 BHI 액체배지에 37℃, 24-42시간 및 pH 7-8로 맞춘 후 배양하였을 때 박테리오신 활성이 320 ㍳/㎖이 가장 높게 나타났다. 박테리오신에 가수분해효소를 처리하였을 때 trypsin, subtilisin A, α-chymotrypsin, proteinase K에서 활성이 소실되어 S. warneri AW25가 생산하는 항균물질이 펩타이드성임을 확인하였다. 이 박테리오신은 강산과 약염기성에서 안정하였으며 강염기성에서는 불안정한 것으로 나타났다. 또한 100℃까지 안정하였으며 유기용매에 대한 내성을 확인한 결과 시료가 녹지 않는 100% 농도를 제외한 methanol, ethanol, isopropanol, acetone 80%까지 안정하였으며 acetonitrile은 60% 까지 안정하고 80%에서는 활성이 절반으로 감소함을 확인할 수 있었다. 무기염류나 계면활성제를 1% 농도 처리했을 때 tween-20, tween-80 및 CuSO4를 제외한 0.5 M EDTA, triton X-100, triton X-114, urea, SDS, N-lauroyl sarcosin, MgCl2, NiSO4 및 NaCl에 내성을 보였다.
Isopropanol로 농축한 박테리오신 용액을 사용하여 각 지시균에 대한 MIC50를 구한 결과 L. monocytogenes KCCM 40307 1.31 ㎎/㎖, M. luteus IAM 1056 1.35 ㎎/㎖, B. cereus KCCM 11204 1.82 ㎎/㎖, E. faecium KCCM 12118 1.95 ㎎/㎖으로 이 중에서 감수성이 가장 높은 균주는 L. monocytogenes KCCM 40307으로 나타났다. 또한 박테리오신의 작용기작은 M. luteus IAM 1056 및 L. monocytogenes KCCM 40307에 대하여 흡광도와 생균수가 일정하게 유지되는 것으로 보아 bacteriostatic으로 판단되었다. Isopropanol 농축액을 이용하여 –20℃와 4℃에서 박테리오신의 저장성을 실험하였다. 저장을 시작한 후 –20℃는 25일, 4℃는 20일 까지 온전한 활성을 유지하였으나 이후로 활성이 절반으로 줄어들었으며 35일부터 잔여활성은 160 ㍳/㎖로 나타났다. 박테리오신의 식품 중 Listeria균 억제 가능성을 확인하기 위하여 L. monocytogenes KCCM 40307을 포함한 소시지에 박테리오신을 첨가한 후 초기 CFU/㎖이 감소하여 유지됨을 확인한 결과로부터 박테리오신을 이용하여 육가공품의 품질과 저장기간을 향상시킬 수 있을 것으로 판단된다.
S. warneri AW25를 대량 배양한 후 isopropanol 농축, Sep-Pak C18, RP-HPLC를 통하여 정제 하였으며 최종 specific activity는 3282.05 ㍳/㎎으로 기존 배양액에 비해 5.75배 증가하였으며 총 0.4%의 회수율을 보였다. 정제한 박테리오신의 tricine SDS-PAGE 분석을 통해 분자량이 2.5~3.0 kDa로 추정하였다. 정확한 분자량을 확인하기 위하여 MALDI-TOF MS를 의뢰하여 분석한 결과 S. warneri AW25가 생산하는 박테리오신의 분자량은 2549.594 Da로 확인되었다. 정제된 박테리오신의 N-말단 아미노산 서열을 확인하기 위해 edman sequencing을 의뢰하여 분석한 결과 M-Q-F-I-T-D-L-I-K-K-A-V-D-F-F로 확인되었으며 15잔기를 NCBI에서 protein BLAST를 수행한 결과 epsilon family phenol-soluble modulin과 100% 일치하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Various bacteria were isolated from fermented foods and tested for antibacterial activity using agar well diffusion method. The physicochemical properties of bacteriocin produced by the isolated strain of Staphylococcus warneri AW25, were examined. The bacteriocin showed antibacterial activity against Gram-positive bacteria such as Micrococcus luteus IAM 1056, Bacillus cereus KCCM 11204, Listeria monocytogenes KCCM 40307 and Enterococcus faecium KCCM 12118. Enterotoxin A and H were detected in S. warneri AW25 by PCR analysis. The bacteriocin was stable at up to 100℃ for 120 min and at pH value from 2.0 to 8.0. Bacteriocin activity was not affected at up to 80% of organic solvents like methanol, ethanol, acetone, and isopropanol. Bacteriocin was resistant to 1.0% concentration of 0.5 M EDTA, Triton X-100, Triton X-114, urea, SDS, N-lauryl sarcosine, MgCl2, NiSO4 and NaCl. In addition, the bacteriocin activity was removed by treatment with trypsin, subtilisinA, α-chymotrypsin and proteinase K. The approximate half minimal inhibitory concentration (MIC50) of crude concentrate against M. luteus IAM 1056, L. monocytogenes KCCM 40307, B. cereus KCCM 11204 and E. faecium KCCM 12118 was 1.35 ㎎/㎖, 1.31 ㎎/㎖, 1.82 ㎎/㎖ and 1.95 ㎎/㎖ respectively. The bacteriocin exhibited its antibacterial activity through bacteriostatic action against M. luteus IAM 1056 and L. monocytogenes KCCM 40307. The crude bacteriocin was stable at –20℃ and 4℃ for 25 day and 20 day respectively. The number of viable cells of L. monocytogenes KCCM 40307 started to decrease after addition of bacteriocin to the sausage. The purification of bacteriocin was performed by isopropanol concentration, Sep-Pak C18 cartridges and RP-HPLC. The purification resulted in a final yield of 0.4% and a 5.75-fold increase in the specific activity. Tricine SDS‐PAGE analysis showed its molecular weight was about 2500 Da. The exact molecular weight was determined to be 2550 Da by MALDI-TOF MS analysis. The partial N-terminal amino acid sequences of bacteriocin were determined to be M-Q-F-I-T-D-L-I-K-K-A-V-D-F-F, the same N-terminal amino acid sequences as epsilon family phenol-soluble modulin of staphylococcus.

목차 (Table of Contents)

• 목 차
• Ⅰ. 서 론 1
• 1. 박테리오신 1
• 2. Staphylococcus 속 3
• 3. Staphylococcus 속 유래 박테리오신 5
• 4. 연구목적 8
• Ⅱ. 실험재료 및 방법 9
• 1. 실험재료 9
• 1) 배지조성 9
• 2) 가수분해효소 9
• 3) Chemicals 10
• 4) 박테리오신 정제용 컬럼 10
• 2. 실험방법 11
• 1) 미생물 분리 및 박테리오신 생산균주 선발 11
• 2) 박테리오신 생산균주 동정 11
• 3) 주사전자현미경을 이용한 세포형태 관찰 12
• 4) Genomic DNA 분리 12
• 5) PCR 분석을 통한 장독소 유전자 확인 13
• 6) 배양조건의 영향 조사 15
• (1) 배양온도 영향 15
• (2) 배양초기 pH 영향 15
• (3) 영양분 조성 영향 15
• (4) 박테리오신 생산 최적화 16
• 7) 물리화학적 특성조사 16
• (1) 가수분해효소의 영향 16
• (2) 열안정성 17
• (3) pH 안정성 18
• (4) 유기용매안정성 18
• (5) 염 및 계면활성제에 대한 내성 18
• 8) 박테리오신 농도별 지시균의 감수성 19
• 9) 박테리오신의 작용기작 19
• 10) 박테리오신 저장성 20
• 11) 식품에서 Listeria균 증식 억제 효과 20
• 12) 박테리오신의 정제 20
• (1) S. warneri AW25 배양 20
• (2) Isopropanol 농축 및 투석 21
• (3) Sep-Pak을 이용한 정제 21
• (4) RP-HPLC (reverse phase-high performance liquid chromatography) 21
• 13) Tricine SDS-PAGE 22
• 14) MALDI-TOF mass spectrometry 분석 23
• 15) N-terminal sequencing 분석 23
• Ⅲ. 결 과 24
• 1. 박테리오신 생산균주 선별 및 동정 24
• 2. 주사전자현미경을 이용한 세포형태 관찰 25
• 3. PCR 분석을 통한 장독소 유전자 확인 26
• 4. 항균 스펙트럼 27
• 5. 배양조건의 영향 조사 28
• 1) 배양온도 영향 28
• 2) 초기배지 pH 영향 30
• 3) 영양분 조성 영향 32
• 4) 박테리오신 생산 최적화 33
• 6. 물리화학적 특성 조사 35
• 1) 가수분해효소의 영향 35
• 2) 열안정성 36
• 3) pH 안정성 37
• 4) 유기용매 안정성 38
• 5) 염 및 계면활성제에 대한 내성 39
• 7. 박테리오신 농도별 지시균의 감수성 40
• 8. 박테리오신의 작용기작 41
• 9. 박테리오신의 저장성 43
• 10. 식품에서 Listeria균 증식 억제 효과 44
• 11. 박테리오신의 정제 45
• 1) S. warneri AW25 배양 및 isopropanol 농축 45
• 2) Sep-Pak을 이용한 정제 46
• 3) RP-HPLC (reverse phase-high performance liquid chromatography) 47
• 12. Tricine SDS-PAGE 50
• 13. MALDI-TOF mass spectrometry 분석 51
• 14. N-terminal sequencing 분석 52
• Ⅳ. 결론 및 고찰 53
• 참고문헌 56
• ABSTRACT 68