Cudrania tricuspidata extract and its active compound kaempferol-7-O-glucoside attenuate muscle atrophy by regulating protein turnover

국문 초록 (Abstract)

근감소증(Muscle atrophy)은 노화, 영양부족 및 만성질환 등에 의해 유발되며, 근육량과 근기능이 모두 감소하는 것을 특징으로 한다. 근감소증은 삶의 질을 저하시킬뿐만 아니라, 당뇨, 비만, 골다공증과 같은 질병을 유발하므로, 근감소증을 예방하고 개선하는 것이 중요하다. 근육 내의 단백질은 근단백질의 합성과 분해 사이의 균형에 의해 조절된다. 근단백질의 합성은 저해되고 분해가 촉진될 경우 근감소증이 발생하게 된다.
꾸지뽕(Cudrania tricuspidata Bureau)은 뽕나무과에 속하며 한국, 중국, 일본에서 전통적으로 사용되어 왔다. 꾸지뽕 및 생리활성 성분 kaempferol-7-O-glucoside (KPG)는 항염, 항산화, 항암 등의 다양한 생리활성을 지니고 있다. 그러나, 꾸지뽕과 KPG의 근감소증 개선 효과에 대해서는 아직까지 연구된 바가 없다. 본 연구에서는 꾸지뽕 잎 추출물(C. tricuspidata leaves extract; CLE) 및 생리활성 성분 KPG의 근감소증 개선 효과를 검증하기 위하여 세포 모델로써 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)를 처리한 L6 근관세포, 동물 모델로써 부동화로 근감소증이 유도된 C57BL/6J 마우스를 이용하였다.
TNF-α를 이용하여 근감소를 유도한 L6 근관세포에 CLE 20 및 40 μg/mL와 KPG 25 및 50 μM을 처리하여 세포 수준에서의 근기능 개선 효과를 확인하였다. CLE와 KPG 처리는 근아세포의 분화를 촉진하였을 뿐만 아니라 근단백질 합성에 관여하는 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (PKB/Akt) 경로와 그 하위 인자인 mammalian target of rapamycin (mTOR), 70-kDa ribosomal protein S6 kinase (p70S6K), eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1 (4EBP1)을 활성화하였다. 또한, CLE와 KPG는 근단백질 분해에 있어 중요한 전사 인자인 Forkhead box O3 (FoxO3)를 억제하여 근육 특이적 ubiquitin E3 ligase인 muscle RING-finger protein-1 (MuRF1)과 muscle atrophy F-box (MAFbx/atrogin-1)의 발현을 감소시켰다. CLE와 KPG는 nuclear factor kappa B (NF-κB) 경로와 염증성 사이토카인인 TNF-α, interleukin-6 (IL-6)의 생성을 억제하고, 항산화 효소인 catalase, superoxide dismutase (SOD) 및 glutathione peroxidase (GPx)의 발현을 상향 조절하였다.
동물모델에서는 C57BL/6J 마우스의 뒷다리를 1주일간 고정하여 근위축을 유도한 후, CLE 50 및 150 mg/kg/day를 1주일간 하루 1회씩 경구투여하였다. CLE는 부동화에 의해 감소한 마우스의 근력, 근지구력, 근육 부피 및 질량, 근단면적을 회복시켰다. 분자수준에서 CLE는 PI3K/Akt 경로를 촉진함으로써 mTOR/p70S6K/4EBP1 경로를 활성화하여 근단백질의 합성을 증가시켰고, 단백질 분해와 관련된 FoxO3를 비활성화하여 근단백질의 분해를 억제하였다. 또한, CLE는 염증 반응과 관련된 NF-κB 경로를 억제하여 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6의 발현을 하향 조절하였다.
종합적으로, 본 연구를 통해 CLE와 KPG가 근육 분화 및 근단백질 합성과 관련된 신호전달경로를 활성화하고, 근단백질 분해 및 염증 반응과 관련된 경로는 억제하며 항산화 효과를 촉진함으로써 근감소증을 개선에 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, 꾸지뽕과 KPG는 근감소증 예방 및 개선 효과를 지니는 기능성 소재로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Skeletal muscle atrophy is a condition in which the muscle mass and function are decreased due to various causes, such as inflammation caused by chronic diseases and aging, physical inactivity, and malnutrition. Muscle atrophy not only causes other diseases, but also increases the mortality rate; hence, preventing and treating muscle atrophy are emerging as important tasks.
Cudrania tricuspidata Bureau, also known as cudrang or mandarin melon berry, has been used as a traditional medicine in East Asian countries. It shows various biological activities, including anti-inflammatory, antioxidant, antitumor, hepatoprotective, and neuroprotective activities. Kaempferol-7-O-glucoside (KPG) is one of the main components of the leaves of C. tricuspidata that exerts anti-cancer, antioxidant, and anti-inflammatory effects. However, the protective effects of C. tricuspidata leaf extract (CLE) and KPG on muscle atrophy have not yet been reported. The present study investigated the effects of CLE and KPG on the inhibition of muscle atrophy in tumor necrosis factor alpha (TNF-α)-treated L6 myotubes and immobilization-induced C57BL/6J mice.
CLE and KPG stimulated myoblast differentiation into myotubes by upregulating the myogenic regulatory factors, MyoD, myogenin and myosin heavy chain (MHC). Phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (PKB/Akt) pathway, which regulates both protein anabolism and catabolism, was activated by CLE and KPG in L6 myotubes. CLE and KPG also upregulated the mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway and its downstream factors, 70-kDa ribosomal protein S6 kinase (p70S6K) and eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1 (4EBP1), in TNF-α-treated L6 myotubes. Additionally, the mRNA expression levels of muscle-specific atrogenes, muscle RING-finger protein-1 (MuRF1) and muscle atrophy F-box (MAFbx/atrogin-1) were suppressed by CLE and KPG treatment by blocking the nuclear translocation of forkhead box O3 (FoxO3). CLE and KPG also downregulated the expression levels of proinflammatory cytokines, TNF-α and interleukin-6 (IL-6) by suppressing the nuclear factor kappa B (NF-κB) pathway and upregulating the levels of antioxidant enzymes, including catalase, superoxide dismutase (SOD), and glutathione peroxidase (GPx), at the cellular level.
The effect of CLE on muscle atrophy was investigated in hindlimb-immobilized C57BL/6J mice. CLE significantly recovered the grip strength and exercise capacity of immobilization-treated mice. Oral administration of CLE enhanced the hindlimb muscle volume, mass, and cross-sectional area of muscle fibers in C57BL/6J mice. At the molecular level, the PI3K/Akt/mTOR pathway was downregulated by immobilization, but activated with CLE in the tibialis anterior muscle. In contrast, phosphorylation of FoxO3 by CLE administration decreased the expression levels of ubiquitin E3 ligases, MuRF1 and atrogin-1. CLE also suppressed NF-κB, a transcription factor involved in the inflammatory response, consequently inhibiting TNF-α and IL-6 expression.
Collectively, these results indicate that CLE and KPG improve muscle atrophy by regulating myogenesis, protein turnover-related pathways, inflammatory responses and antioxidant enzymes. Taken together, the current study suggests that C. tricuspidata and KPG may have potential to be used as pharmacological agents for preventing and alleviating muscle atrophy.