Genome-wide secretome을 이용한 당뇨병의 새로운 바이오마커 및 질환 치료 타겟 개발 = Identificaton of new biomarkers and therapeutic targets of diabetes using genome-wide secretome

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Purpose& Contents
〈purpose> : The final aim of this project is to develop biomarkers or disease targets of diabetes, which will be useful for the development, progress, analysis of disease control, and prognosis, using an analysis by genome-wide secretome. For this purpose, 1) we will develop a way of analysis using genome-wide secretome and set up the database, 2) we will obtain secretome database from liver, adipose tissue, inflammatory cells, endothelial cells, and pancreas in cells-animals-humans, 3) we will investigate wether the candidate genes can be used for biomarkers or disease targets.
〈contents>
〈first year〉
1) A development of genome-wide secretome : By using algorithm in human and mouse gene database, we will construct genome-wide secretome.
2) A construction of human diabetes cohort : Human tissue bank will be used for the construction of liver, adipose tissues, pancreas, endothelial and inflammatory cells to obtain tissues and clinical information.
3) An identification of new biomarkers : We will identify new biomarkers from various tissues, which will be investigated in next year.
〈second year〉
1) An identification of new biomarkers using genome-wide secretome : Genome-wide secretome will be used for the identification of new biomarkers and we will confirm whether they are produced and secreted from tissues.
2) An analysis and expension of human diabetes cohort : we will also obtain gene expression database from the samples of diabetes cohort and analyze them for new biomarkers.
3) An investigation of biological importance and relevance of biomarkers : We will analyze the candidate proteins whether they can be used for diabetic biomarkers, by investigating their biological roles.
〈third year〉 A usefulness of biomarkers for diabetes : Using human diabetes cohort, we will adopt an analysis of genome-wide secretome, and finally will integrate the biomarkers to develop the "new biomakers of diabetes", which will be used for the development, progress, analysis of disease control, and prognosis.
Results
1. Development of human-mouse genome-wide secretome database.
1) We developed a secretome database, 396 human protein genes are defined as "human genome-wide seretome".
2) In adipocyte model using conditioned medium, a set of transcriptome database was obtained. It is integrated with the genome-wide secretome, releasing many candidate genes for new biomarkers. Of these, we investigated Serpina3C as a strong candidate biomakers, for its biological role and relationship to diabetes.
2. Developing human-derived-tissue cohort for diabetes study
1) In Gangnam Severance Hospital, we constructed 120 subjects of pancreatectomy patients cohort composed with pancreas tissue, omental/subcutaneous fat tissue, serum after OGTT, and all the clinical information.
2) We also constructed 200 subjects of diabetes serum corhort with full diabetic complication study data
3. Developing novel biomarkers on diabetes targeting Inflammatory/vascular part.
1) We found that beta cell specific Angiopoietin (Ang1) KO mice develop glucose intolerance because of the decreased insulin secretion from islets. In the transcriptome and secretome analysis from microarray data on islets from Ang1 KO mice, we could find Reg1 and Reg2 as the candidate molecules for islet regeneration/proliferation in diabetic setting in mice
2) In the pancreatectomy corhot, we demonstrated that the development of diabetes in pancreatic cancer patients is mainly originated from impaired insulin secretion by some factors secreted from tumor tissue
3) We demonstrated that relative glucagon-to-insulin ratio can be a parameter for uncontrolled diabetes in nonobese long duration diabetic patient.
4. Identification of hepatokine candidate genes, which their expression is sensitive to nutrient levels.
1) In response to starvation, expressions of Pgcd, Pgat1, Fgf4, Egfb4, selectoprotein, Angiopoietin-like 4 were elevated in primary mouse hepatocytes.
2) In contrast, upon nutrient rich condition, expressions of lcit1, Bdnf, Bmp2 were increased in mouse hepatocytes.
3) After treatment of metformin which reduces insulin resistance, expression of Gdf15, Fst, Fos, Hmgb2, Cyr61, Lgals3, Endod1, Cldn1, Id3, Ctgf were elevated in mouse hepatocytes, suggesting those gene expression are associated with insulin sensitivity.
5. Genome-wide secretome analysis to identify novel hepatokine candidate genes related to insulin resistance.
1) The expression of Gdf15 gene was elevated in response to insulin and metformin. When Gdf15 is depleted, the expression of gluconeogenic gene was increased, suggesting that, hepatic Gdf15 regulates gluconeogenesis.
2) Expression of Hmgb2, Endod1, Cldn1, Cyr61, Id3, Ctgf was decreased in livers from high fat diet-fed mice.
5. Analysis of the potential relevance of novel hepatokine as a biomarker and therapeutic target for the development of diabetes : The expression of GDF15, Fos, Cyr61 were elevated in liver tissues from diabetic subjects compared to non-diabetic subjects.
Expected Contribution
1) New biomarkers of diabetes will pave a way for the development, progress, analysis of disease control, and prognosis.
2) This project will contribute in identifying and developing a new therapeutic targets and drugs, as well as new theories of diabetes.
3) The cohort which we developed as diabetic patient-derived-tissue bank is unique and valuable cohort that all fat/pancreas/serum were collected from each single subject. The cohort will be used to find new targets in diabetes which is applicable for human.
4) The candidate molecule like Reg1 and Reg2 which was developed in Ang KO mice study, and new parameter such as glucagon-to-insulin ratio can be a new target for diabetes treatment and further study will be necessary.
5) The knowhow to develop human cohort, sorting out intra-islet endothelial cell, and doing RNAseq with small amount of RNA which were build up during this study will be applied for next step study.
6) This study will provide a physiological basis to identify molecular targets with great potential value in the development of biomarker and therapeutic strategies to treat insulin resistance in diabetes.〈/third>〈/second>〈/first>〈/contents>〈/purpose>

국문 초록 (Abstract)

연구의 목적 및 내용
<연구 목적> : 본 과제의 최종목표는 genome-wide secretome 분석을 통해 당뇨병의 발생, 진행, 치료 평가, 예후 등에 이용될 수 있는 새로운 바이오마커 및 질환 치료 타 겟을 개발하는 것임. 이를 위하여 1) Genome-wide secretome 분석 방법을 개발 하고 데이터베이스를 구축하며, 2) 세포-동물-환자 모델의 간, 지방, 소화관, 염증세포, 혈액내피세포, 췌장 등 대사 중심 장기에서 유전체 데이터베이스를 확보하며, 3) 도출된 유전자 secretome 데이터를 통합 분석하여 당뇨병의 질병 관련 바이오마커 후보를 선정하고, 4) 각 분비 단백질의 생물학적 특성을 규명 하여 임상적 바이오마커로서의 유용성을 검증함.
<연구개발내용>
- 본 연구는 당뇨병의 발생, 진행, 치료평가, 예후와 관련된 임상 지표를 개발 하려는 목적으로 구성되었음. 환자의 혈액에서 다양한 분비 단백질의 변화를 토 대로 질병의 진단, 인슐린 저항성의 평가, 질병의 경과, 합병증 예측뿐만 아니라 개별 맞춤 치료에 이용될 수도 있는 새로운 바이오마커를 개발하고자 함.
<1년차 연구내용>
1) Genome-wide secretome 분석 방법의 개발 및 데이터베이스 구축 : 사람과 마우스의 유전체 데이터베이스에 단백질 예측 알고리듬을 적용, genome-widesecretome 데이터베이스를 구축함.
2) 당뇨병 환자 인체유래물 코호트 구축 : 인체유래물은행을 통해 당뇨병 환자 및 대조군의 간, 지방, 췌도, 혈관/염증세포 및 임상정보를 수집하고 당뇨병 환자에게 적용할 수 있는 secretome 분석 준비를 완료함.
3) 지방조직, 염증세포주/혈액내피세포주/동물모델, 인슐린 저항성을 나타내는 간세포 모델에서 신규 바이오마커를 발굴함.
<2년차 연구내용>
1) Genome-wide secretome 분석에 의한 새로운 바이오마커 발굴 : Genome-wide secretome에 의한 바이오마커 후보군을 도출하고, 도출된 유전자의 발현과 단백질 검출을 검증함. 또한 유전자의 당뇨병 관련성을 세포/동물 모델에서 분석함.
2) 당뇨병 환자 인체유래물 코호트 확장 및 분석 : 당뇨병 환자 및 대조군의 코호트 확장 및 분양과 질병관리본부 인체유래물 센터 샘플을 확보함으로써, 각 장기에서 인체에서 유래한 전사체 기반 secretome 분석을 실시함.
3) 각 장기에서 유래한 당뇨병 관련 바이오마커의 생물학적 기능 탐구 : 세포-동물-환자 모델에서 도출된 바이오마커 후보군을 대상으로 생물학적 기능을 탐구함.
<3년차 연구내용>
1) 당뇨병 환자에서 바이오마커의 선정 및 유용성 검증 : 환자 코호트 샘플에서 지방조직, 염증/내피세포, 간 등의 조직 유래 데이터베이스의 genome-wide secretome을 적용하고 분석하여, 임상 데이터에 기초한 새로운 바이오마커 후보군을 도출함.
2) 바이오마커의 항체 개발과 검출 방법 개발 : 각 장기에서 도출된 새로운 바이오마커 후보군에 대하여 환자 혈청에서의 검출 방법을 ELISA, RIA 등의 방법으로 확립함.
3) 바이오마커의 질병 관련성 규명과 질환 타겟으로의 가능성 타진 : 세포-동물-환자 모델에서 확보된 새로운 바이오마커들의 질환 관련성을 분자세포생물학적으로 규명하고 질환 타겟으로서의 가능성을 타진함.
연구개발성과
1. Genome-wide secretome 확보
1) 사람과 마우스의 공동 secretome 데이터베이스를 구축하고 human protein data와 교차분석하여 총 396개의 human genome-wide seretome을 확보함.
2) 지방세포 모델에서 conditioned medium을 이용한 유전체 데이터베이스를 적용하여 다수의 유전자를 확보하였고, 이중 Serpina3C가 분비 단백질로 검출되어 genome-wide secretome의 적용 실례를 확보함.
3) 이 데이터베이스를 모든 세부과제에 제공하여 당뇨병 관련 바이오마커를 발굴하는데 효율적으로 이용될 수 있게 함.
2. 지방세포 유래 바이오마커로서 Serpina3C에 대한 기능 분석을 실시하여 지방세포 분화에 결정적 영향을 함을 규명함.
3. 인체유래물 코호트 확립
1) 강남세브란스 병원 인체조직 코호트 구축 및 분석 완료 : 췌장절제술 환자경구당부하검사 혈청, 췌장 조직, 피하/내장 지방 조직, 임상정보 코호트를 구축함. 또한 당뇨병환자 혈청 및 임상정보 코호트를 구축함.
2) 인체 간조직 확보 후 3세부와 협력연구 진행, 인체 지방조직 확보 후 제1세부와 협력연구를 진행함.
4. 당뇨병 염증/혈관 관련 바이오마커 발굴
1) Angiopoietin KO 생쥐의 췌도에서 transcriptome 및 secretome 분석 후 분비단백질 후보군 확보함(Reg1, Reg2).
2) 생쥐 및 인체 췌도내 혈관내피세포 transcriptome 연구 진행 기반을 확보함.
3) 췌장절제술 환자 코호트 분석으로 췌장암에서 당뇨병 유발 기전을 규명함.
4) 당뇨병 환자에서 glucagon-to-insulin ratio가 혈당조절 관련 바이오마커로서 역할 함을 제시함.
5. 인슐린 저항성을 나타내는 간세포에서 분비되는 신규 hepatokine 후보 유전자의 탐색과 규명
1) 영양분 결핍에 반응하는 Pgcd, Pgat1, Fgf4, Egfb4 등 분비성 단백질 유전자를 확보함.
2) 인슐린 민감도가 증가 시 발현되는 hepatokine 후보군으로 metformin에 의해 과발현되는 분비성 단백질을 코딩하는 유전자(Gdf15, Fst 등)을 최종 선별함.
6. 인슐린 저항성 동물 모델의 간 조직에서의 genome-wide secretome 분석과 신규 hepatokine 후보 유전자 규명
1) Gdf15이 간에서 분비되어 간내 당 생성을 조절하는 기작을 가짐을 확인함.
Hmgb2, Endod1, Cldn1, Cyr61, Id3, Ctgf는 인슐린 저항성 모델에서 발현이 감소함.
7. 당뇨병 진행에 대한 바이오마커 및 치료 타겟으로서 신규 hepatokine의 가능성 분석
1) 당뇨 환자 간조직에서 metformin에 의해 조절되어지는 hepatokine의 발현을 qRT-PCR로 확인함.
2) 당뇨 환자 간조직에서 Gdf15, Fos, Cyr61의 발현이 증가함을 확인함. 이는 당뇨 질환과 Gdf15, Fos, Cyr61가 상관관계가 있음을 의미함.
연구개발성과의 활용계획(기대효과)
1) 당뇨병의 미충족 의료 수요의 해결: 전 세계적으로 유병률이 높은 당뇨병 환자들의 진단 및 임상 경과를 나타내는 지표를 개발함으로써, 의사와 환자에게 질병 치료를 모니터할 수 있는 새로운 방법을 제시하고, 환자 개개인에게 맞는 치료방법을 선택할 수 있는 데이터를 제공하며, 합병증을 지연하거나 감소할 수 있는 새로운 치료제 개발에도 초석이 될 수 있음.
2) 대사질환 연구의 학문적 발전: 다양한 질병에서 혈액 지표를 발굴하는 새로운 접근 방법을 소개하고, 발굴된 바이오마커들의 생물학적 특성을 연구함으로써 대사질환 연구에서 국제적인 경쟁 우위를 점유할 수 있음.
3) 본 연구에서 구축한 췌장절제술 환자 경구당부하검사 코호트는 췌장 조직과, 지방 조직, 그리고 혈청을 한 대상에서 수집한 희귀성 있는 코호트로, 해당 코호트를 이용하여 당뇨병 관련 새로운 biomarker를 찾기 위한 연구에 지속적으로 활용될 계획임.
4) 본 연구에서 발굴된 췌도 microenviroment(혈관세포, 염증세포)를 타켓으로 한 당뇨병 관련 새로운 바이오마커는 (Reg1, Reg2, Glucagon-to-insulin ratio 등) 당뇨병 발병/치료의 새로운 기전 연구에 기여할 것으로 판단되고, 추후 후 속연구를 통해서 임상에서 적용 가능성을 검증함으로서 궁극적으로는 새로운 약제 개발의 후보로 활용할 수 있겠음.
5) 본 연구과제를 진행하면서 획득한 인체유래물 코호트 구축 노하우, 췌도 및 FACS sorting 한 극소량의 췌도 혈관내피세포에서 microarray 또는 RNAseq 진행 노하우, secretome 분석 및 새로운 분비단백질 후보 도출 노하우 등은 추후 후속 연구 진행에 유용하게 활용될 계획임.
6)본 연구에 의해 제시된, 간의 인슐린 저항성과 밀접한 관련이 있는 신규 heptokine 후보군의 규명은 인슐린 저항성의 병리를 나타내는 당뇨병에 대한 바이오마커 개발과 새로운 치료법의 기반을 마련하는데 초석이 될 것으로 기대됨.