Plant functional genomics using virus-induced gene silencing (VIGS) and molecular characterization of NbCHMP1 and NbBTF3 : VIGS(virus-induced gene silencing) 시스템을 이용한 식물의 기능성 유전자 대량발굴과 NbCHMP1, NbBTF3 유전자의 분자적 특성 분석

국문 초록 (Abstract)

제1장
VIGS 현상은 재조합형 바이러스가 host 유전인자의 염기 서열을 인지하는 것에 의해 중재되는 상동 의존형 RNA 붕괴의 결과로써 내생의 유전자들의 기능 분석을 위해 일시적인 knockout에 도달하게 하는데 사용할 수 있다.
그래서 VIGS 기술은 주로 담배나 애기장대풀과 같은 한정된 host의 수에서 몇 개의 virus의 사용만으로 제한된다. 본 연구에서는 High throughput VIGS 기술을 이용하여 고추와 담배 EST를 유전자의 source로 기능유전체 연구를 수행하고자 한다. 담배의 종자, 뿌리, 줄기, 꽃에서 RNA를 분리하여 Lambda ZAPll cDNA library를 제조하였고 3000개의 cDNA를 임의로 염기 서열을 분석하였다. 3000개의 염기 서열 중에서 식물 조직 발달, 호르몬 작용, 신호 전달 등에 관련된 유전자 492개와 기능이 밝혀지지 않은 유전자 725개 등 총 1217개를 선발하였다. 선발된 1217개의 EST를 VIGS vector로 cloning하고 재조합된 VIGS plasmid를 Agrobacterium으로 형질 전환하였다. 각각의 유전자 당 6개의 Nicotiana benthamiana 식물체를 사용하여 Agrobacterium 침투 방법으로 VIGS를 수행하였다. VIGS의 positive 대조구로는 cellulose synthase와 Rubisco small subunit 유전자를 사용하였다. Virus 침투 후 2-3주 후 정상적인 온실 조건(24℃)에서 식물체의 형질 변화를 vector 대조구와 비교하여 조사하였다. 표현형은 세포 사멸, 잎의 황색화, 생장 억제, 비정상인 기관, 너무 빠른 노화, 꽃의 기형화, 정부우세성의 파괴 등으로 나누어 분석하였다. 1217개 유전자 중 136개 유전자에서 표현형 변화가 유도되었고 VIGS로 표현형의 변화가 크게 일어난 유전자들의 발현양상과 기능을 분자생물학적, 생화학적, 세포생물학적 기법을 이용하여 분석하였다. 유도되는 표현형과 해당 유전자의 염기 서열을 PHP, CGI, MySQL 프로그램을 이용하여 database로 구축하였다.
제2장
사람의 경우 CHMP1은 핵에서는 염색질 구조의 변형에 관해, endosome에서는 소포낭의 이동에 관여하는 역할을 하는 두 가지의 기능을 가지는 단백질이라고 알려졌다. 최근에 옥수수에서 CHMP1의 상동으로 밝혀진 sal1은 옥수수의 내배유에서 호분 세포층의 발달에 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 Nicotiana benthamiana에서 얻은 CHMP1의 상동인 NbCHMP1의 분자적 특성과 세포질의기능을 연구하였다. NbCHMP1는 아미노 말단에 2부로 나누어진 핵 조준 신호를 가지고 있는 단백질이고 다양한 식물 종으로부터의 대응 유전인자들과 높은 비율의 상동관계를 나타낸다. NbCHMP1의 전령RNA는 뿌리, 줄기, 잎과 꽃에서 유사한 비율로 발견된다. NbCHMP1의 아미노 말단 80개의 아미노산 펩티드와 GFP 단백질을 연합시킨 NbCHMP1(N)-GFP단백질이 핵으로 조준되는데 반해 NbCHMP1의 전체 길이와 GFP 단백질을 연합시킨 NbCHMP1(F)-GFP단백짙은 cytosol에 분포하므로 식물에서의 NbCHMP1 단백질은 이중 표적을 나타냄을 보였다. 효모에서 NbCHMP1의 과다발현은 생장에는 영향을 주지 않았고 flow cytometry에 기초한 기관들이 생육하게 하였고 발현 단백질은 독특한 반점형태로 cytosol로 조준되었다. NbCHMP1의 VIGS는 VIGS line에서 식물의 생육 가능성 흑은 발달에 중대한 영향을 주지 않고 잎의 형태와 색깔면에서 미묘한 변화의 결과를 보일 뿐이었다. 그러므로 CHMP1 동족체는 옥수수 endosome에서 호분 세포층의 결정에 가장 중요한 역할을 하는 것과는 대조적으로, dicotyledonous 식물의 생장하는 조직에서의 발달에는 중대한 역할을 하지 않는다.
제3장
BTF3는 일찍이 전사의 개시에 연루되어 있다고 여겨지는 자궁 경부 세포에서 정의된 단백질이다.전사에서의 BTF3의 륵정한 역할은 아직은 불분명하다. 본 연구에서는 Nicotiana benthamiana로부터 BTF3와 상동하는 유전자 cloning하여 얻었다. 이 유전자, 즉 NbBTF3는 아미노 말단에 핵으로 조준되는 신호 가지면 160개의 아미노산을 인지하며 다양한 식물 종으로부터의 대응 유전 인자들과 높은 비율의 상동관계를 나타낸다. NbBTF3의 전령RNA는 뿌리, 줄기와 꽃에서 유사한 비율로 발견된다. NbBTF3의 아미노 말단 80개의 아미노산 펩티드와 GFP 단백질을 연합시킨 단백질은 핵으로 조준되는 것을 볼 수 있었다. NbBTF3의 VIGS는 표현형면에서는 잎의 형태나 색깔에 변화를 가져왔다. 그러나 NbBTF3가 침묵된 조건에서 밝은 녹색부분의 잎에서 원형질체를 분리하여 엽록소를 관찰해 보았을 때 엽록체의 개수나 엽록소의 함량은 대조구인 TRV의 75-80%로 나타났다. 색소체의 RNA 합성효소인 PEP에 의해 전사되는 색소체의 광합성 관련 유전자들의 발현 양상은 NbBTF3가 침묵하였을 때 감소하는 결과를 보였다. 또 multi-subunit RNA 합성효소인 PEP의 발현 수준도 감소하였다. 엽록체의 유전자 뿐 아니라 미토콘드리아의 유전자들의 발현양상도 NbBTF3의 침묵조건에서 발현수준이 감소하는 결과를 보였다. 이 사실은 general transcription factor인 NbBTF3가 NEP유전자의 발현을 조절하므로서 협록체 내의 유전자의 전사에 관여한다는 것을 시사하고 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Chapter 1
The VIGS phenomenon can be used in transient knockout approaches for functional analyses of endogenous genes, as a consequence of homology-dependent RNA degradation mediated by a recombinant virus harboring a host gene sequence (Baulcombe, 1999). So far, VIGS technology has been restricted to the use ofa fsw viruses in a limited number of hosts, mainly Nicotiana benthamiana and Arabidopsis thaliana (Voinnet, 2001). In this study, we carried out functional genomics with high throughput VIGS using selected cDNAs of Nicotiana benthamiana. Among 3,000 sequenced ESTs, total 1,217 genes were cloned into VIGS vectors, and their function was examined by VIGS. The 1,217 genes include 492 genes that are putatively involved in plant development, hormone action, and signal transduction, and 725 unknown/hypothetical genes. The phenotype/sequence database is being constructed (hnp://kribb.re.k.), which contains the information on the o bserved plant phenotypes from VIGS-mediated gene silencing, the EST sequences, and Blas-X results.
Chapter 2
In human, CHMP1 encodes a protein with dual function, which plays a role in both modification of chromatin structure in the nucleus and vesicle trafficking in the endosome. Recently, it was found that sall, the CHMP1 homolog in maize, plays a critical role in development of aleurone cell layers in maize endosperm. In this study, we investigated molecular characteristics and cellular function a CHMP1 homolog from Nicotiana benthamiana, designated NbCHMP1 NbCHMP1 encoded a small protein with a bipartite nuclear localization signal at the N-terminus, and exhibited high sequence homology with the corresponding genes from diverse plant and animal species. The NbCHMP1 mRNA was detected in stems, roots, flowers, and leaves at the similar levels. The GFP fusion protein of the full length NbCHMP1 distributed in the cytosol as distinct forms, while the GFP fusion protein of its N-terminal 80 aa peptide was targeted to the nucleus, indicating dual-targeting of the NbCHMP 1 protein in plants. Overexpression of NbCHMP1 in yeast did not affect growth and viability of the organism based on the flow cytometry, and the expressed protein was localized in the cytosol as distinctive specks. Virus-induced gene silencing of NbCHMP1 resulted in subtle alteration in leaf morphology and in leaf color, without significantly affecting plant viability or development in the VIGS lines. Thus CHMP1 homolog apparently does not play a critical role in development of the vegetative tissues of the dicotyledonous plants, in contrast to its essential role in the determination of aleurone cell layers in maize endosperm.
Chapter 3
BTF3 is a protein initially identified in HeLa cells that may be involved in the initiation of transcription, During large-scale VIGS screening in N. benthamiana, I found that gene silencing of NbBTF3 encoding a NTF3 homolog in N. benthamiana, resulted in leaf yellowing phenotypes. In this study, I investigated molecular characteristics and putative functions of NbBTF3 of N. benthamiana. NbBTF3 encoded a putative 160 amino acid protein with a nuclear localization signal at the N-terminus, and exhibited high sequence homology with the corresponding genes from diverse plant species. The NbBTF3 mRNA was expressed in stems, roots, leaves and flowers at the similar levels. The NbBTF3 protein was targeted the nucleus when the N-terminal 80 as (including NLS) was expressed as a GFP fusion protein. Suppression of NbBTF3 by virus-induced gene silencing did not significantly affect the growth of plants, while changes were observed in leaf morphology and in leaf color. Chloroplast numbers and chlorophyll contents in the light-green sectors of the TRV:NbBTF3 leaves was reduced to 75-80% of the TRV control. Furthermore, expression of the chloroplast- and mitochondria-encoded genes was downregulated by gene silencing of nuclear-targeted NbBTP3. Based on these results we speculate that NEP-mediated transcription including transcription of the PEP gene encoding plastid-encoded RNA polymerase in the chloroplasts was inhibited by reduced transcription of the NEP gene in the nucleus, hence the reduced amounts of chloroplast-targeted NEP, due to depletion of the general transcription factor NbBTF. The nuclear-targeted BTF3 may play a role in the transcription of nuclear NEP gene.

목차 (Table of Contents)

• Table of Contents = ⅰ
• List of Tables = ⅲ
• List of Figure = ⅳ
• List of Abbreviation = ⅴ
• Chapter1 Plant Functional Genomics Using VIGS(Vires - induced Gene Silencing) = 1
• Ⅰ. Introduction = 2
• Ⅱ. Material and Methods = 5
• Ⅲ. Results and Discussion = 7
• Construction of the cDNA library of Nicotiana and sequencing analysis = 7
• Large-scale cloning of the cDNAs into VIGS vector containing the TRV genome = 7
• VIGS using Agrobacterium infiltration = 7
• VIGS phenotype analysis / target gene = 9
• Phenotype database construction = 9
• Ⅳ. Reference = 49
• Chapter2 Molecular Characterization of NbCHMP1 Encoding a Plant Homolog of the Human CHAP1 = 51
• Ⅰ. Introduction = 52
• Ⅱ. Material and Methods = 54
• Ⅲ. Results and Discussion = 57
• NbCHMP1 as a plant homolog of the human CHMP1 = 57
• Expression patterns of NbCHMP1 = 57
• Subcellular localization of NbCHMP1 in plants = 60
• Overexpression of NbCHMP1 : GFP in yeast = 62
• VIGS of NbCHMP1 and suppression of the endogenous transcripts = 64
• Structural analysis of leaf cells = 66
• Ⅳ. Reference = 69
• Chapter3 Molecular Characterization of NbBTF3 = 71
• Ⅰ. Introduction = 72
• Ⅱ. Material and Methods = 75
• Ⅲ. Results and Discussion = 78
• Sequence analysis of the NbBTF3 cDNA = 78
• Expression of the NbBTF3 gene in various plant tissues and in response to stress conditions = 78
• Subcellular localization of the NbBTF3 : GFP fusion protein = 81
• Suppression of the NbBTF3 transcripts in the VIGS plants = 81
• Analysis of chloroplast numbers and chlorophyll contents = 83
• Expression patterns of the NEP- and PEP-regulated chloroplast genes in the TRV : NbBTF3 VIGS lines = 86
• Ⅳ. Reference = 89
• ABSTRACT = 92