어류 serotransferrin 계통 유전자의 진화와 구조적 다양화: 정형 bi-lobal form과 비정형 mono-/multi-lobal form의 비교 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study compared the structural diversity and evolutionary patterns of typical
bi-domain genes （BDGs） and non-bi-domain genes （nBDGs） in fish serotransferrin
（sTF） lineages. Fish sTF sequences were collected across major fish lineages and
analyzed at the DNA, RNA, amino acid sequence, and three-dimensional structural
levels. A total of 422 sTF sequences from 258 species were retained for downstream
analyses, including 366 BDG sequences and 56 nBDG sequences.
Exon-structure analysis showed that the 17-exon organization was the predominant
form of sTF BDG and was widely conserved across major fish lineages, suggesting that
it represents a long-standing canonical genomic framework. In contrast, non-canonical
BDG exon structures containing 16-, 18-, or 9–15–exons were also identified,
suggesting that exon fusion, exon loss, exon splitting, intron gain, and exon-boundary
shifts have contributed to exon-intron-level diversification.
At the protein level, fish sTF BDG largely retained typical transferrin features,
including N-/C-domain organization, a molecular weight of approximately 70–80 kDa,
conserved D-Y-Y-H iron-binding residues, and stable predicted three-dimensional
folding. However, lineage- or paralog-associated variation was observed in isoelectric
point, the number of N-glycosylation sites, cysteine residue patterns, and iron-binding residue patterns.
Basic pI values were relatively enriched in basal fish lineages, whereas
acidic pI values were predominant in Neoteleostei. Although the D-Y-Y-H motif was
broadly conserved, residue variation was mainly detected in teleost sequences, and
atypicality scores tended to be higher in the N-domain than in the C-domain.
Analysis of nBDGs identified mono-, tri-, tetra-, and penta-domain sTF candidates
across multiple fish lineages, including Cyclostomata, Chondrichthyes, early teleosts, and
Neoteleostei. Phylogenetic analysis using the individual domain sequences of both BDGs
and nBDGs showed that the canonical N- and C-domains formed distinct clades. These
clades were then used as references to assess the phylogenetic affinities of each domain
within the nBDGs. Mono-domain sTFs predominantly showed C-domain-like features,
whereas tri-domain and tetra-domain sTFs mainly exhibited N-C-C and N-C-N-C
arrangements, respectively. Domain-based phylogenetic analysis, exon-structure
comparison, and predicted three-dimensional structures suggested that nBDGs may have
arisen through domain duplication, domain loss, or domain rearrangement within the
conserved BDG framework, while retaining globular lobes and transferrin-like folds
corresponding to their domain numbers.
RT-PCR using tissue cDNA from Hemitrygon akajei and Scyliorhinus torazame
detected expected amplicons corresponding to bi-lobal sTF and tri-lobal or mono-lobal
sTF candidate transcripts. These results suggest that nBDGs identified by in silico
screening may be transcribed in fish tissues, although further quantitative and functional
analyses under infection, iron overload, and iron-deficiency conditions are required.
Taken together, fish sTF was found to be strongly conserved around the 17-exon and
bi-domain structures, while also possessing the potential for diverse modifications and
expansion at the exon-structure and domain-structure levels. By presenting both the
conserved architecture and atypical structural diversity of fish sTF, this study proposes a
revised evolutionary hypothesis for the fish sTF gene family. These findings are expected
to provide a foundation for future studies on iron homeostasis, nutritional immunity, and
the functional significance of domain-structure diversity.

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 어류 serotransferrin （sTF）의 typical bi-domain gene
（BDG）과 non-bi-domain gene （nBDG）을 대상으로 구조적 다양성과 진화
양상을 비교 분석하였다. 주요 어류 계통을 대상으로 sTF 서열을 수집하
고, DNA, RNA, 아미노산 서열 및 3D 구조 수준에서 BDG와 nBDG의 특
징을 비교하였다. 최종적으로 258종에서 422개의 sTF 서열을 확보하였으
며, 이 중 366개는 BDG, 56개는 nBDG로 분류되었다.
sTF BDG 유전자의 exon 구조 분석 결과, 17-exon 구조가 가장 높은
비율로 관찰되었고 주요 어류 계통 전반에서 확인되었다. 이는 17-exon 구
조가 어류 sTF의 표준적인 genomic framework로 장기간 보존되어 왔음
을 시사한다. 반면, 16-, 18- 및 9–15-exon 구조를 가지는 비표준 BDG도
확인되었으며, 이들은 exon fusion, exon loss, exon splitting, intron gain
및 exon boundary shift와 같은 exon-intron 구조의 변화 기작을 통해 형
성되었을 가능성이 있다.
단백질 수준에서 어류 sTF BDG은 전형적인 N-/C-domain 구조, 약 70
–80 kDa의 분자량, 보존적인 D-Y-Y-H iron-binding residues 및 안정적
인 3D folding 구조를 전반적으로 유지하였다. 그러나 pI, N-glycosylation
site 수, cysteine residue 및 iron-binding residue 패턴에서는 계통별 또는
paralog 수준의 변이가 관찰되었다. 특히 basic pI 서열은 기저 어류 계통
에서 상대적으로 많이 나타난 반면, acidic pI 서열은 Neoteleostei에서 우
세하였다. 또한 iron-binding residue의 변이는 대부분 teleost 서열에서 확
인되었으며, C-domain보다 N-domain에서 더 높은 비정형성을 보이는 경
향이 나타났다.
nBDG 분석에서는 mono-, tri-, tetra- 및 penta-domain sTF 후보가
확인되었으며, 이들은 Cyclostomata, Chondrichthyes, early teleosts 및
Neoteleostei를 포함한 여러 어류 계통에서 관찰되었다. BDG와 nBDG의
각 domain 서열을 함께 이용한 분자계통 분석에서는 전형적인 N-domain
과 C-domain이 서로 구분되는 clade를 형성하였고, 이를 기준으로 nBDG
를 구성하는 각 domain의 N-/C-domain 계통적 유사성을 판별하였다.
Mono-domain sTF은 대체로 C-domain-like 특징을 보였고, tri-domain
sTF은 주로 N-C-C, tetra-domain sTF은 주로 N-C-N-C 배열을 나타냈
다. Domain 기반 분자계통 분석, exon 구조 비교 및 예측 3D 구조 분석
결과, nBDG는 기존 BDG framework에서 domain duplication, domain loss
또는 domain rearrangement를 통해 형성되었을 가능성이 있으며, domain
수에 대응하는 globular lobe와 transferrin-like fold를 유지할 수 있음을
확인하였다.
노랑가오리（Hemitrygon akajei）와 두툽상어（Scyliorhinus torazame）를
대상으로 RT-PCR을 수행한 결과, bi-lobal sTF뿐 아니라 tri-lobal 또는
mono-lobal sTF 후보 transcript에 해당하는 예상 크기의 band가 조직
cDNA에서 확인되었다. 이는 in silico에서 탐색된 nBDG가 단순한
annotation 후보가 아니라 실제 조직에서 transcription될 가능성이 있음을
보여준다. 하지만 endpoint RT-PCR은 정량 분석이 아니므로, 향후
RT-qPCR 및 감염·철 처리 조건에서의 발현 반응 비교가 필요하다.
종합하면, 어류 sTF은 17-exon 및 bi-domain 구조를 중심으로 강하게
보존되어 있으나, exon 구조와 domain 구조 수준에서 다양한 변형과 확장
가능성을 가진 유전자군임을 확인하였다. 본 연구는 어류 sTF의 보존적
구조와 비전형적 구조 다양성을 함께 제시함으로써, 어류 sTF 유전자군의
수정된 진화 가설을 제안하였다. 이러한 결과는 향후 철 항상성,
nutritional immunity 및 domain 구조 다양성의 기능적 의미에 관한 연구
에 기초 자료를 제공할 수 있으리라 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• I. 서론 1
• II. 재료 및 방법 5
• 2.1. 어류 계통군별 serotransferrin （sTF） 데이터베이스 구축 및 분석 5
• 2.1.1. 어류 계통군별 sTF 서열 확보 5
• 2.1.2. 서열 그룹화 및 데이터베이스 구축 5
• 2.1.3. DNA 서열의 특성 분석 6
• 2.1.4. RNA 서열의 특성 분석 6
• 2.1.5. Amino acid 서열의 특성 분석 6
• 2.1.6. 단백질 3D 구조의 특성 분석 7
• 2.1.7. 분자계통 분석 7
• 2.2. Transcript 발현의 실험적 검증 7
• 2.2.1. 시료 확보 7
• 2.2.2. 조직 채취 8
• 2.2.3. Total RNA 추출, cDNA 합성, RT-PCR 8
• III. 결과 10
• 3.1. 어류 sTF 서열 수집 및 분류 10
• 3.2. 어류 sTF bi-domain gene （BDG）의구조적변이와계통의존적진화 10
• 3.2.1. sTF BDG의 exon 구조 10
• 3.2.2. Coding exon 길이의 차이 13
• 3.2.3. sTF BDG의 exon 구조 변이 13
• 3.2.4. RNA 수준 분석 16
• 3.2.5. sTF isoelectric point （pI）값의 계통 특이적 분포 16
• 3.2.6. sTF N-glycosylation site 수의 계통별 분포 18
• 3.2.7. 철 결합 잔기의 보존성 및 진화, domain별 변이 18
• 3.2.8. Cysteine 잔기의 패턴 21
• 3.2.9. N-/C-domain 서열의 보존성 23
• 3.2.10. sTF BDG의 단백질 구조 분석 23
• 3.2.11. Bi-lobal sTF의 단백질 3D 구조 분석 23
• 3.3. 어류 sTF non-bi-domain gene （nBDG）의 분포 및 구조 특성 분석 27
• 3.3.1. sTF nBDG의 분포 27
• 3.3.2. Mono-domain sTF 유전자의 exon 패턴 30
• 3.3.3. Tri-domain sTF 유전자의 exon 패턴 30
• 3.3.4. Tetra-domain sTF 유전자의 exon 패턴 30
• 3.3.5. sTF domain의 분자계통 분석 32
• 3.3.6. sTF domain 구조의 패턴 32
• 3.3.7. Non-bi-domain sTF의 단백질 3D 구조 분석 32
• 3.4. 어류 non-bi-lobal sTF transcript의 RT-PCR 검출 36
• IV. 고찰 40
• 요약 47
• 감사의 글 49
• 참고 문헌 51