방사선 내성 두경부암에서 종양줄기세포 내 유전자 발현의 분석

국문 초록 (Abstract)

(1) 두경부암 세포주에서 종양줄기세포의 분리

 * 방사선을 조사하지 않은 두경부암 세포주와 방사선 내성을 유도한 두경부암 세포주(SCC25, SCC15, QLL1)를 대상으로 serum free media에서 세포 배양을 한 후, sphere-forming cell을 분리함.
 * 분리된 sphere-forming cell을 대상으로 stem cell marker인 CK5, OCT4, SOX2 등의 발현 여부를 면역조직화학염색을 통해 확인하고, sphere forming cell을 1000~10000개 가량 nude mice에 innoculation한 후 differentiated cancer tissue로 분화되는지 확인함. 이러한 과정을 통해 serum free media에서 배양한 sphere-forming cell이 종양줄기세포임을 확인함.

(2) 종양줄기세포에서 방사선 내성 획득 전후 유전자 발현의 변화를 분석함

 * 방사선을 조사하지 않은 두경부암 세포주 기원의 종양줄기세포와 방사선 내성을 유도한 두경부암 세포주 기원의 종양줄기세포를 대상으로 각각 cDNA array와 proteomics를 시행함.
 * 3가지 두경부암 세포주에서 공통적으로 방사선 내성 획득 후 발현의 변화를 보인 유전자들을 선별함.
 * 선별된 유전자들을 대상으로 Ingenuity Pathway Analysis를 시행하여 방사선 내성과 연관이 있을 것으로 예상되는 유전자들을 선별함.

(3) 선별된 유전자들이 방사선 내성과 연관이 있는지 확인함.

 * BALB/c-nu Slc를 2군으로 나누어 방사선 내성 두경부암 세포주에서 유래한 종양줄기세포와 방사선 내성과 관련된 유전자에 대한 shRNA를 처리한 종양줄기세포를 각각 nude mice의 등에 주사한 후 종양의 장경이 1cm이 될 때까지 키움. 이 때 각 군별로 tumor formation rate와 tumor growth pattern을 조사함. 이후 각각의 군에 대하여 선형 가속기(Varian 21iX)를 이용하여 external irradiation을 한번에 2G씩 10G가 될 때까지 시행한 후 종양의 크기의 변화를 측정함. 선별된 유전자가 방사선 내성과 관련이 있다면 shRNA를 처리한 종양줄기세포에서 유래한 종양은 방사선 치료에 대한 내성이 감소할 것으로 예상됨.

(4) 방사선 내성 관련 유전자의 발현이 방사선 내성을 예측할 수 있는 marker로 사용할 수 있는지 ex vivo study를 통해 확인

 * 두경부암을 진단 받고 초치료로 방사선 치료를 받은 환자들 중 치료 결과가 확인된 환자들의 방사선 치료 전 파라핀 포매 조직을 확보함. 이 파라핀 포매 조직에서의 방사선 내성 관련 유전자들의 발현 정도를 확인한 후 이를 환자들의 방사선 치료 결과와 비교 분석함. 이를 통해 방사선 내성 관련 유전자의 발현이 방사선 내성을 예측할 수 있는 지표로 사용될 수 있는지 확인함.