Taxonomic Study of Novel Bacteria Isolated from Ginseng Rhizosphere and Heavy Metal Resistance Mediated by a Siderophore Producing Bacterium in Panax ginseng Meyer

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Panax ginseng is one of the most important medicinal plants in Asian countries and is usually harvested after 5 to 6 years of cultivation in Korea. Heavy metal exposure is a type of abiotic stress that can induce oxidative stress and decrease the quality of the ginseng crop. Utilization of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) can be the one way to induce heavy metal resistance in plants. Siderophore-producing rhizobacteria (SPR) is an important PGPRs to improve nutrient uptake and promote plant growth against heave metal stress. Therefore, SPR may be capable of bioremediating heavy metal contamination. In this study, we aimed to isolate and identify potential SPR on heavy metal resistance in P. ginseng.
Based on the culture dependent method and polyphasic approach, the five novel strains isolated from ginseng rhizosphere were belonging to the genus Rhodanobacter, Paraburkholderia, Lysobacter, Ornithinimicrobium and Mesorhizobium, designated as DCY112T, DCY115T, DCY117T, DCY118T, and DCY119T. The screening of five isolates had been carried out by in vitro studies for assessment the potentials of bioconversion of ginsenosides, indole acetic acid (IAA) production, siderophores production, phosphates solubilization, antagonistic activity, and heavy metal resistant activities. Compared with all the tested isolates, the siderophore-producing bacteria Mesorhizobium panacihumi DCY119T had higher heavy metal resistance, especially strong resistance to iron (MICFe: 32mM), therefore, this bacterium was chosen as the SPR candidate for further pot test.
To investigate the response of P. ginseng seedlings inoculated with the SPR candidate against Fe toxicity, two experiments was designated as in planta pot tests and in vitro medium tests. In planta- grown 2-year-old ginseng seedlings was inoculated with the SPR candidate, and Fe was added or not to investigate the ability of the SPR to reduce oxidative stress and enhance resistance to heavy metal stress. According to the results, ten minutes dipping of 108 CFU/mL DCY119T was enough to prime 2-years old ginseng seedlings against given Fe stress and increased the biomass and sugars contents to promote ginseng growth. Seedlings treated with the SPR DCY119T could increase antioxidant chemicals (total phenolic, total flavonoid) contents and ROS scavenging genes expression to reduce oxidative stress and prevent Fe toxicity. Secondly, the SPR candidate, DCY119T, was cultured in a variety of Fe-supplemented culture media or Fe-contaminated soil extract media and the response of Fe toxicity was assessed by antioxidant activity, IAA, and siderophores production activities. When Fe concentrations in the culture medium was increased, DCY119T grew until 16mM Fe, DPPH scavenging, IAA and siderophores production activities increased, similar results were obtained for Fe-contaminated soil extract media. Together, these results indicate that DCY119T can produce siderophores and scavenge ROS to reduce Fe-induced toxicity, in addition to providing IAA to promote seedling growth, thereby conferring inoculated ginseng with heavy metal resistance.
Inoculation of ginseng seedlings with the siderophore-producing rhizobacteria DCY119T decreased the toxic effects of Fe by reducing oxidative stress and promoting growth, indicating that SPR DCY119T can be used for bioremediation of heavy metal contamination.

국문 초록 (Abstract)

인삼은 수 천년 전부터 아시아 여러 나라에서 가장 중요한 약용식물 중 하나로 이용되어왔으며, 한국에서는 5~6년 재배 한 후 수확하고 있다. 긴 재배기간으로 인해 토양내 염류가 집적되고, 토양내 미생물의 다양성이 감소되어 병원성 곰팡이에 의한 감염이 4년근 이후 급속히 증가되어 화학적 토양 살균제 등이 암묵적으로 처리되고있다. 염류장애 및 토양 산성화는 인삼의 경작지, 연작지에서 인삼의 생리적 불균형을 초래하여 더욱 중금속에 취약하게 되어 인삼의 품질을 저하시키는 요인이 되고 있다. 산성화된 토양에서 산화된 철이온은 환경스트레스를 더욱 가속화 시킬 수 있는데 철 이온을 조절할 수 있는 siderophore생성능이 우수한 미생물을 활용하여 인삼 뿌리 내 생성된 ROS를 제거하고, 인삼의 중금속 내성을 증진 시킬 수 있는 새로운 환경 친화적인 산화적 스트레스 극복 방안을 본 연구 결과로 제시하고 있다. Siderophore 생성능이 우수한 인삼 근권에 정착된 신규 세균을 분리하였으며, 이들의 인삼 생육 촉진 효과를 증명하였고 신규한 세균에 의해 인삼의 토양내 중금속 스트레스 내성이 증진효과를 검증하였다.
인삼 근권으로부터 분리된 5개의 새로운 균주는 속명(genus) Rhodanobacter, Paraburkholderia, Lysobacter, Ornithinimicrobium 그리고 Mesorhizobium에 속했으며, DCY112T, DCY115T, DCY117T, DCY118T 그리고 DCY119T로 명명하였다. 분류학적 특성을 바탕으로 진세노사이드 생물전환, IAA 생산, Siderophore 생산, phosphates 가용화, 길항 작용 그리고 중금속 내성 작용의 평가를 위해 분리된 신종균주의 특성을 구명하였다. 또한 in vitro 연구 결과, Siderophore 고생성 균주인 Mesorhizobium panacihumi DCY119T는 강한 중금속 내성을 나타내었으며, 특히 Fe (MICFe: 32mM)에 강한 내성을 보여주었다. 그리고 Mesorhizobium panacihumi DCY119T는 인삼을 이용한 생육실험 결과 철이온에 의한 인삼의 산화적 스트레스를 경감시킬 수 있고 인삼의 세근 발달을 통한 양분 흡수률을 높여 인삼의 생육을 더욱 촉진 시킬 수 있는 생물 제재로 사료된다.
인삼내 Fe 독성을 감소시키는 메커니즘을 조사하기 위해 2년생 묘삼에 접종한 Mesorhizobium panacihumi DCY119T 을 이용하여 in planta 화분(pot)실험과 in vitro 실험을 진행하였다. 이 결과, 2년생 묘삼에 108 CFU/mL DCY119T 10분 처리 시, 처리된Fe 스트레스를 완전히 극복하였고, 묘삼의 바이오매스와 당 성분들이 증가됨을 통해 묘삼의 생장을 촉진하는 것을 확인할 수 있었다. DCY119T가 처리된 묘삼은 항산화 성분 (total phenolic, total flavonoid)과 산화 스트레스를 줄이고 Fe 독성을 막는 ROS scavenging에 관여하는 유전자의 발현이 증대 되었다. 실제 인삼이 재배되는 토양에 Fe 염을 고농도로 처리하고 이를 분획하여 DCY119T를 배양하여 실제 토양내에서 균주의 활력과 생물 촉진 활성이 유지되고 있는지 확인한 결과 상당히 높은 농도가 처리된 토양 추출물에서도 본 균주의 활성은 유지됨을 알 수 있었고, 항산화, IAA, siderophores생산 활성도 상대적 정량 측정할 수 있었다. 배양 배지의 Fe농도 증가에서, DCY119T는 16mM 까지 자랐고, DPPH scavenging, IAA, Siderophore 생산 활성이 증가하였으며, Fe가 오염된 흙 추출물이 함유된 배지에서도 유사한 결과가 도출되었다. 그러므로, Siderophore를 생산하는 DCY119T는 Fe 스트레스의 독성을 줄이기 위해 인삼 뿌리내의 ROS를 감소시키고, 식물의 중금속 내성을 유도한다는 것을 알 수 있었다.
본 연구 결과, Siderophore 생성능이 우수한 신규 미생물 Mesorhizobium panacihumi DCY119T 는 향후 인삼의 산화적 스트레스를 줄일 수 있는 생물학적 제제로 이용될 수 있으며, DCY119T 의 ROS scavenging 활성과 인삼의 외부 중금속 스트레스 경감 작용에 대한 기초 연구를 수행하였으나 보다 명확학 상호 작용 기작은 향후 연구를 통해 구명되어져야 할 것이다.

목차 (Table of Contents)

• I. GENERAL INTRODUCTION
• II. LITERATURE REVIEW
• 2.1. Polyphasic Taxonomy
• 2.1.1. Genotypic approach
• 2.1.2. Phenotypic approach
• 2.2. Plant growth promoting rhizobacteria
• 2.3. Siderophore producing rhizobacteria
• 2.4. Effects of Environmental stresses in plants
• 2.4.1. Effects of abiotic and biotic stress in plants
• 2.4.2. Effects of heavy metal stress in plants
• 2.4.3. Oxidative stress induced by heavy metal stress in plants
• 2.5. Heavy metal resistance mechanism by plants and PGPRs
• 2.5.1. Heavy metal resistance mechanisms by plants
• 2.5.2. Mechanisms in alleviating of heavy metal toxicity by PGPRs
• III. Taxonomic Study of Five Novel Bacteria Isolated from Ginseng Rhizosphere
• 3.1. Abstract
• 3.2. Introduction
• 3.3. Material and Methods
• 3.3.1. Isolation and culture condition
• 3.3.2. 16S rRNA sequencing and phylogenetic tree construction
• 3.3.3. Dertermination of phenotypic characteristics
• 3.3.4. Determination of DNA G + C content and DNA–DNA hybridization
• 3.3.5. Chemotaxonomic analysis
• 3.3.6. In vitro screening of bioconversion, plant growth promotion, antagonistic activity, and heavy metal resistance
• 3.4. Results and discussion
• 3.4.1. Phylogenetic analysis
• 3.4.2. Physiological and biochemical characteristics
• 3.4.3. DNA G + C content and DNA–DNA relatedness
• 3.4.4. Chemotaxonomic characteristics
• 3.4.5. In vitro assessment of bioconversion, plant growth promotion, antagonistic activity, and heavy metal resistance
• 3.4.6. Description of five novel strains
• IV. Heavy Metal Resistance of Panax ginseng Mediated by a Siderophore Producing Rhizoacterium Mesorhizobium panacihumi DCY119T
• 4.1. Abstract
• 4.2. Introduction
• 4.3. Material and Methods
• 4.3.1. Correlation of optical density at 600 nm and colony forming units
• 4.3.2. Compatibility of strain DCY119T with two-year-old ginseng seedlings
• 4.3.3. Assessment of the iron tolerance of P. ginseng
• 4.3.4. In planta pot tests of resistance of P. ginseng inoculated with strain DCY119T to Fe stress
• 4.3.5. In vitro medium assay of heavy metal resistance by strain DCY119T against Fe stress
• 4.4. Results and discussion
• 4.4.1. Correlation of OD600 values and CFU/mL of strain DCY119T
• 4.4.2. Compatibility of strain DCY119T in P. ginseng seedlings
• 4.4.3. Assessment of the iron tolerance of P. ginseng
• 4.4.4. Induction of Fe stress resistance in P. ginseng by strain DCY119T
• 4.4.5. Heavy metal resistant ability of strain DCY119T against Fe toxicity
• V. GENERAL CONCLUSION
• VI. REFERENCES
• 국문초록
• ACKNOWLEDGEMENT