상피성장인자 수용체 억제제 획득 내성 비소세포폐암의 차별적인 에너지 대사 특성을 활용한 치료법 연구 = Therapeutic approaches targeting differential energy metabolisms in epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistant non-small cell lung cancer

국문 초록 (Abstract)

상피성장인자 수용체(EGFR)는 세포의 생장, 분열, 생존 및 사멸을 조절하는 세포막 수용체이다. 특히 폐암에서 EGFR의 발현이 높고 이는 종양의 생장, 전이를 촉진하고 항암 화학 요법(conventional chemotherapy)에 저항성을 나타낸다. 상피성장인자 수용체 억제제(EGFR-TKIs)는 EGFR 활성 변이에 선택적으로 작용해 폐암환자의 전체 생존율을 올려주었다. 1세대 EGFR-TKIs (게피티닙, 얼로티닙)는 EGFR 엑손 19번 결손 혹은 엑손 21번 L858R 변이에 효과적이다. 하지만 EGFR-TKI의 장기 복용은 10-14 개월 내에 내성을 유발했다. EGFR 엑손 20번의 T790M 변이는 획득 내성에서 가장 빈번하게 발견되는 변이로 3 세대 EGFR-TKI인 오시머티닙은 T790M변이를 표적화하여 등장하였다. 하지만 3 세대 EGFR-TKI 또한 엑손 20번의 C797S변이 등으로 내성 발생이 보고되는 상황이다. 따라서 EGFR-TKI의 획득 내성에 관여하는 신규 표적에 대한 추가 연구가 필요하다. 대사 리프로그래밍(metabolic reprogramming)은 암의 생존을 위한 주요 특성 중 하나이다. 빠른 생장에 수반되는 에너지, 아미노산, 핵산 그리고 산화·환원의 스트레스를 해결하기 위해 변형된 당 대사나 글루타민 대사가 나타난다. 최근 이러한 에너지 대사는 항암제의 주요 타겟으로 활발하게 연구 중이다.
본 연구에서는 1세대 EGFR-TKI 저항성 폐암에서 차별적인 대사적 특징을 찾고자 하였고 이러한 특성을 통해 효과적으로 저항성을 극복할 수 있다는 가능성을 제시한다. 이를 증명하기 위하여 EGFR-TKI 저항성 폐암세포에서 변형된 당 대사와 글루타민 대사의 특징을 탐구하고 해당 대사 특징을 억제하는 약물로 효과적인 항암 억제 효과를 나타내는 지 평가하는 것을 연구 목표로 설정하였다.
먼저 EGFR 표적항암제인 게피티닙과 얼로티닙을 장기간 처리하여 배양한 비소세포성 폐암세포주인 게피티닙 저항성 HCC827 (HCC827 GR), PC9 (PC9 GR)과 얼로티닙 저항성 H292 (H292 ER), H1993 (H1993 ER)을 구축한 후 세포 성장과 EGFR 신호전달 변화를 평가하여 내성 발현을 확인하였다. EGFR-TKI 획득 내성 세포주는 모세포와 비교하여 포도당의 흡수율과 소모량, 그리고 해당과정 수용력(glycolysis capacity)이 낮았다. 주사 전자현미경에서 미토콘드리아의 크기는 비숫하나 전자전달계 조절자에 의한 세포 호흡의 변동폭이나 미토콘드리아 막 전위는 저항성 세포주에서 더 높았다. 또한 총 ATP 생산 대비 미토콘드리아 유래 ATP생산 비중이 모세포보다 높음을 확인하였다. 이러한 EGFR-TKI 저항성 폐암세포주에서 미토콘드리아의 재활성화는 complex 1 억제제인 펜포르민의 타겟으로 작동하며, 실제 펜포르민은 저항성세포에서 모세포보다 더 큰 성장 억제를 보였다. 펜포르민의 처리는 NAD+/NADH 비율과 아스파르트산의 생합성을 억제하고 폐암 이종이식 누드 마우스 모델에서도 EGFR-TKI 저항성 폐암세포에 대한 차별적 암 성장 억제 효과를 나타냈다. EGFR-TKI 저항성 폐암세포에서 해당과정의 핵심효소인 헥소키나아제2과발현은 해당과정 재활성화를 일으켰고, 펜포르민의 성장 억제효과를 회복시켰다. 해당과정과 산화적 인산화 사이에 암세포의 대사적 가소성은 펜포르민의 반응성에 영향을 미친다는 사실을 관찰하였다. 이를 통해 XFp 분석기로 측정한 세포의 대사적 특징을 기반으로 대사적 가소성을 규정하고, 펜포르민의 생장 억제 효과와의 관계를 텐서플로우 기법으로 예측하였다.
글루타민 고갈시 EGFR-TKI 저항성 세포인 HCC827 GR과 H292 ER에서 모세포와 차별적인 생장 억제가 나타났다. 13C5-글루타민을 이용한 GSH의 안정동위원소(isotopologue) 분석에서 GSH 합성에 HCC827 GR이 더 의존적임을 관찰하였다. 글루타민의 고갈은 HCC827 GR에서 더 큰 GSH의 고갈을 수반하였고 세포내 ROS 발생에 취약함을 확인하였다. 반면 H292 ER에서 글루타민은 모세포보다 알파 케토글루타르산으로의 전환율이 높았다. 이에 글루타민의 고갈은 TCA 중간체 감소 및 전자전달계의 활성 감소로 이어져 세포내 총 ATP 생성과 미토콘드리아 유래 ATP 생성 비중의 감소가 나타났다. CB-839는 글루타미나제 억제제로 세포 내 글루타민의 글루탐산으로의 전환을 억제한다. HCC827 GR과 H292 ER은 글루타민 이용에 이질성을 나타내지만 글루타민 대사의 초기 단계를 억제하는 CB-839의 처리는 EGFR-TKI 저항성 세포에서 차별적으로 생장을 억제하고 암세포 증식 표지자인 Ki-67 면적을 감소시켰다.
이상을 종합하면 1) EGFR-TKI획득 내성 세포에서 미토콘드리아의 재활성화가 나타나고 글루타민의 의존도가 높아지며, 2) 이러한 대사적 특징을 통해 기존 임상진입 약물들인 펜포르민과 CB-839가 EGFR-TKI 저항성 폐암세포 치료를 위한 신약 재창출 후보가 될 수 있음을 새롭게 규명하였다. 또한 암세포의 대사 이질성을 확인하고, 이에 따라 달라지는 약물 반응성을 기계학습을 통해 예측할 수 있는 초기 방안을 제시한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Epidermal growth factor receptor (EGFR) is a cell membrane receptor that regulates cell growth, division, survival, and death. In particular, the expression of EGFR is high in non-small cell lung cancer (NSCLC) and active mutations of EGFR are frequently found, which promotes tumor growth and metastasis, and eventually induce resistance to conventional chemotherapies. EGFR-tyrosine kinase inhibitors (TKis) selectively act on the EGFR mutations and increase overall survival rate in NSCLC patients. First generation agents of EGFR-TKis (e.g., gefitinib and erlotinib) have been effective on NSCLC harboring EGFR exon 19 deletion or exon 21 L858R mutation. However, long-term treatment of EGFR-TKis induces the acquired resistance within 10-14 months. T790M mutation in EGFR exon 20 is the most frequently detected in the resistant tumor tissues, and osimertinib, third generation EGFR-TKi, is highly effective by targeting the T790M mutation. However, clinical results have revealed that long-term use of osimertinib also resulted in resistance due to the C797S mutation in exon 20. As acquired resistance to EGFR-TKi shows a poor clinical prognosis, so further studies are needed. Metabolic reprogramming is one of the key characteristics of cancer survival in tumor microenvironment. Altered glucose or glutamine metabolism appears to meet demands for energy, amino acid, nucleic acids, and oxidation/reduction stress accompanying rapid cell growth. Recently, several energy metabolism pathways have been being studied as potential new targets for the intractable cancer. This study tried to find the distinct metabolic characteristics of EGFR-TKI-resistant NSCLC cell lines, and propose a hypothesis that the resistance can be effectively overcome by interfering these. In order to prove this hypothesis, I tried to identify the characteristics of altered glucose and glutamine metabolisms in EGFR-TKI-resistant NSCLCs and to assess whether the pharmacological inhibitors targeting the altered metabolisms exhibit significant anti-tumor effects in vitro and in vivo.
First, gefitinib-resistant HCC827 (HCC827 GR), PC9 (PC9 GR), and erlotinib-resistant H292 (H292 ER), H1993 (H1993 ER) were established by long-term culture with gefitinib or erlotinib, and resistance to the EGFR-TKis was confirmed by cell growth inhibition tests and EGFR signaling changes. EGFR-TKI-resistant NSCLC cell lines (HCC827 GR, H1993 ER) showed the less glucose uptake and glycolysis capacity compared to their parental cell lines. Although morphology of mitochondria was similar in transmission electron microscopy, the oxygen consumption rate (OCR) and the mitochondrial membrane potential (MMP) were higher in the resistant cancer cell lines. Furthermore, in comparison to the parental cells, the contribution ratio of mitochondria derived ATP was higher. Mitochondria reactivation can be targeted by phenformin, a complex 1 inhibitor, and cell proliferation of EGFR-TKI-resistant NSCLC cells was more potently inhibited by phenformin than parental cells. Phenformin treatment suppressed the NAD+/NADH ratio and aspartic acid biosynthesis in HCC827 GR. Xenograft assays using HCC827 and HCC827 GR confirmed that tumor growth inhibition by phenformin was only found in HCC827 GR-implanted mice. In hexokinase-deficient H292 ER, stable overexpression of hexokinase 2 increased glycolysis activity and reversed the growth inhibitory effect of phenformin. Considering a hypothesis that the metabolic plasticity between glycolysis and oxidative phosphorylation determines the anti-cancer effect of phenformin, metabolic plasticity was defined as the metabolic characteristics (OCR and ECAR values) assessed by the XFp analyzer, and the relationship between the growth inhibitory effect of phenformin and metabolic plasticity was analyzed and predicted by TensorFlow.
Cell growth of the two acquired-EGFR-TKI-resistant lung cancer cells lines (HCC827 GR and H292 ER) depends on glutamine. In HCC827 GR, glutamine deficiency caused reduced GSH synthesis and, subsequently, enhanced ROS generation relative to their parental cells, HCC827. On the other hand, in H292 ER, glutamine mainly acted as a carbon source for TCA-cycle intermediates, and its depletion led to reduced mitochondrial ATP production. CB-839, a specific GLS inhibitor, inhibited the latter’s conversion of glutamine to glutamate and exerted enhanced anti-proliferating effects on the two acquired EGFR-TKI-resistant lung cancer cell lines versus their parental cell lines. Moreover, oral administration of CB-839 significantly suppressed HCC827 GR tumor growth in the xenograft model. These findings suggest that glutamine dependency in acquired EGFR-TKI-resistant lung cancer is heterogeneous and that inhibition of glutamine metabolism by CB-839 may serve as a therapeutic tool for acquired EGFR-TKI-resistant lung cancer.
Collectively, I newly identified in this thesis that 1) oxidative phosphorylation and glutamine metabolism are increased in the several acquired EGFR-TKI-resistant NSCLC cells and 2) safety-proven two agents, phenformin targeting mitochondria complex 1 and CB-839 targeting glutaminase could be considered potential therapeutic agents against EGFR-TKI resistant NSCLC.

목차 (Table of Contents)

• I. 서론 1
• II. 시약 및 실험방법
• 1. 시약 및 항체 10
• 2. 세포 배양 11
• 3. 세포증식, 3D spheroid 증식 관찰 11
• 4. EGFR 유전자 돌연변이 분석 12
• 5. 단백질샘플 및 발현분석 13
• 6. NGS 분석 13
• 7. 세포대사능 분석(XFp analyzer) 14
• 8. 세포내 대사체 샘플 및 LC-MS/MS 분석 14
• 9. 포도당 흡수능 분석(Glucose uptake assay) 17
• 10. 미토콘드리아 막 전위 분석 18
• 11. 주사전자현미경법(Transmission electron microscopy) 18
• 12. NAD+/NADH 비율 측정 18
• 13. HK2 과발현 및 결손 세포주 확립 19
• 14. 이종이식모델 동물실험 (Xenograft nude mouse model) 19
• 15. 혈장 내 젖산 검출 20
• 16. 면역조직화학염색(Immunohistochemistry) 20
• 17. Tensorflow 분석 20
• 18. 유세포분석(Flow cytometry) 21
• 19. 통계분석 21
• III. 결과
• 1. EGFR-TKI 내성 폐암 세포주의 미토콘드리아 재활성 및 타겟 규명 22
• 1-1. 비소세포폐암 세포주에서 게피티닙 및 얼로티닙 내성발현 및 EGFR 수용체 변이 동정 22
• 1-2. EGF에 의한 하위 신호 조절 25
• 1-3. 해당과정과 산화적 인산화 관련 유전자 및 단백질 발현 변화 28
• 1-4. 해당과정 활성 평가 31
• 1-5. 미토콘드리아 산화적 인산화 활성 평가 33
• 1-6. 펜포르민에 의한 EGFR-TKI 내성 폐암 세포 증식 억제 효과 37
• 1-7. 마우스 이종이식모델에서 펜포르민에 의한 EGFR-TKI 내성 폐암 세포 증식 억제 효과 40
• 1-8. HK2 과발현에 따른 대사 활성 및 펜포르민에 의한 증식 효과 42
• 1-9. 딥러닝을 통한 펜포르민의 반응성 예측 45
• 2. EGFR-TKI 내성 폐암 세포주의 글루타민 대사 이질성 및 타겟 규명 49
• 2-1. 글루타민 고갈의 차별적 세포 증식 억제 효과 49
• 2-2. 글루타민 고갈에 따른 세포 주기 분석 52
• 2-3. 글루타미나제 억제제인 CB-839에 의한 차별적 세포 증식 억제 효과 54
• 2-4. 마우스 이종이식모델에서 CB-839의 생장 억제 효과 57
• 2-5. GSH 합성 탄소원으로의 역할 60
• 2-6. TCA 중간체 합성 탄소원으로의 역할 64
• 2-7. 미토콘드리아 유래 에너지 생성에서의 역할 69
• IV. 고찰 72
• V. 참고문헌 83
• VI. Abstract 99

참고문헌 (Reference)

1. Mitochondria and cancer, Zong , W. X. , Rabinowitz , J. D. , & White , E., 61 ( 5 ) , 667-676. doi:10.1016/j.molcel.2016.02.011, , 2016

2. Cancer statistics , 2017, Siegel RL , Miller KD , Jemal A, 67 ( 1 ) , 7-30. doi:10.3322/caac.21387, , 2017

3. Global cancer statistics , 2012, Torre , L.A. ; Bray , F. ; Siegel , R.L . ; Ferlay , J. ; Lortet-Tieulent , J. ; Jemal , A ., 65 ( 2 ) , 87- 108. doi:10.3322/caac.21262, , 2015

4. Metabolomics and Isotope Tracing, Jang , C. , Chen , L. , & Rabinowitz , J. D., 173 ( 4 ) , 822-837. doi:10.1016/j.cell.2018.03.055, , 2018

5. Fundamentals of cancer metabolism, De Berardinis , R. J. , & Chandel , N. S., 2 ( 5 ) . doi:10.1126/sciadv.1600200, , 2016

6. Upstream and downstream of mTOR ., Hay , N. , & Sonenberg , N., 18 ( 16 ) , 1926-1945. doi:10.1101/gad.1212704, , 2004

7. The normal acid base status of mice, Iversen , N. K. , Malte , H. , Baatrup , E. , & Wang , T., 180 ( 2-3 ) , 252-257. doi:10.1016/j.resp.2011.11.015, , 2012

8. Hallmarks of cancer : The next generation, Hanahan D , Weinberg RA ., 144 ( 5 ) , 646-674. doi:10.1016/j.cell.2011.02.013, , 2011

9. Lactate Metabolism in Human Lung Tumors ., Faubert , B. , Li , K. Y. , Cai , L. , Hensley , C. T. , Kim , J. , Zacharias , L. G. , . . . DeBerardinis , R. J ., 171 ( 2 ) , 358-+ . doi:10.1016/j.cell.2017.09.019, , 2017

10. Metabolic Heterogeneity in Human Lung Tumors ., Hensley , C. T. , Faubert , B. , Yuan , Q. , Lev-Cohain , N. , Jin , E. , Kim , J. , . . . DeBerardinis , R. J ., 164 ( 4 ) , 681-694. doi:10.1016/j.cell.2015.12.034, , 2016

11. Targeting mitochondria as an anticancer strategy, Dong , L. F. , & Neuzil , J ., 39 ( 1 ) . doi:10.1186/s40880-019- 0412-6, , 2019

12. Incidence of lactic acidosis in metformin users ., Stang , M. , Wysowski , D. K. , & Butler-Jones , D., 22 ( 6 ) , 925-927. doi:10.2337/diacare.22.6.925, , 1999

13. NUTRITION NEEDS OF MAMMALIAN CELLS IN TISSUE CULTURE, Eagle , H., 122 ( 3168 ) , 501-504. doi:10.1126/science.122.3168.501, , 1955

14. `` Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy, Downward , J ., 3 ( 1 ) , 11-22. doi:10.1038/nrc969, , 2003

15. Drug discovery with explainable artificial intelligence, Jimenez-Luna , J. , Grisoni , F. , & Schneider , G., 2 ( 10 ) , 573-584. doi:10.1038/s42256-020-00236-4, , 2020

16. Metformin and reduced risk of cancer in diabetic patients, Evans , J. M. M. , Donnelly , L. A. , Emslie-Smith , A. M. , Alessi , D. R. , & Morris , A. D., 330 ( 7503 ) , 1304-1305. doi:10.1136/bmj.38415.708634.F7, , 2005

17. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer ., Sharma , S. V. , Bell , D. W. , Settleman , J. , & Haber , D. A ., 7 ( 3 ) , 169-181. doi:10.1038/nrc2088, , 2007

18. Repositioning metformin for cancer prevention and treatment, Quinn , B. J. , Kitagawa , H. , Memmott , R. M. , Gills , J. J. , & Dennis , P. A ., 24 ( 9 ) , 469-480. doi:10.1016/j.tem.2013.05.004, , 2013

19. Clinical applications of metabolomics in oncology : a review, Spratlin , J. L. , Serkova , N. J. , & Eckhardt , S. G., 15 ( 2 ) , 431-440. doi:10.1158/1078-0432.Ccr-08-1059, , 2009

20. Targeting cancer cell mitochondria as a therapeutic approach, Wen , S. J. , Zhu , D. Q. , & Huang , P., 5 ( 1 ) , 53-67. doi:10.4155/fmc.12.190, , 2013

21. From Krebs to clinic : glutamine metabolism to cancer therapy, Altman , B. J. , Stine , Z. E. , & Dang , C. V., 16 ( 10 ) , 619- 634. doi:10.1038/nrc.2016.71, , 2016

22. Linking metabolic reprogramming to therapy resistance in cancer, Morandi , A. , & Indraccolo , S., 1868 ( 1 ) , 1-6. doi:10.1016/j.bbcan.2016.12.004, , 2017

23. Mechanisms and Implications of Metabolic Heterogeneity in Cancer, Kim , J. , & DeBerardinis , R. J ., 30 ( 3 ) , 434-446. doi:10.1016/j.cmet.2019.08.013, , 2019

24. Oxidative phosphorylation as an emerging target in cancer therapy, Ashton , T. M. , McKenna , W. G. , Kunz-Schughart , L. A. , & Higgins , G. S., 24 ( 11 ) , 2482-2490. doi:10.1158/1078-0432.Ccr-17-3070, , 2018

25. Targeting EGFR in Lung Cancer : Current Standards and Developments, Diaz-Serrano , A. , Gella , P. , Jimenez , E. , Zugazagoitia , J. , & Rodriguez , L. P. A ., 78 ( 9 ) , 893-911. doi:10.1007/s40265-018- 0916-4, , 2018

26. Altered Glutamine Metabolism and Therapeutic Opportunities for Lung Cancer, Mohamed , A. , Deng , X. M. , Khuri , F. R. , & Owonikoko , T. K., 15 ( 1 ) , 7-15. doi:10.1016/j.cllc.2013.09.001, , 2014

27. Targeting Metabolic Plasticity and flexibility Dynamics for Cancer Therapy, Fendt , S. M. , Frezza , C. , & Erez , A ., 10 ( 12 ) , 1797-1807. doi:10.1158/2159-8290.Cd-20-0844, , 2020

28. New perspective for an old antidiabetic drug : metformin as anticancer agent, Leone , A. , Di Gennaro , E. , Bruzzese , F. , Avallone , A. , & Budillon , A ., 159 , 355-376. doi:10.1007/978-3- 642-38007-5_21, , 2014

29. Glutamine and cancer : cell biology , physiology , and clinical opportunities, Hensley , C. T. , Wasti , A. T. , & DeBerardinis , R. J ., 123 ( 9 ) , 3678-3684. doi:10.1172/jci69600, , 2013

30. Resistance mechanisms to osimertinib in EGFR-mutated nonsmall cell lung cancer ., Leonetti , A. , Sharma , S. , Minari , R. , Perego , P. , Giovannetti , E. , & Tiseo , M., 121 ( 9 ) , 725-737. doi:10.1038/s41416-019-0573-8, , 2019

31. Inhibition of GLS suppresses proliferation and promotes apoptosis in prostate cancer, Zhang , J. F. , Mao , S. Y. , Guo , Y. D. , Wu , Y. , Yao , X. D. , & Huang , Y ., 39. doi:10.1042/bsr20181826, , 2019

32. Q 's next : the diverse functions of glutamine in metabolism , cell biology and cancer, DeBerardinis , R. J. , & Cheng , T., 29 ( 3 ) , 313-324. doi:10.1038/onc.2009.358, , 2010

33. The control of the metabolic switch in cancers by oncogenes and tumor suppressor genes, Levine , A. J. , & Puzio-Kuter , A. M., 330 ( 6009 ) , 1340-1344. doi:10.1126/science.1193494, , 2010

34. New drugs for breast cancer subtypes : Targeting driver pathways to overcome resistance, Curigliano , G., 38 ( 4 ) , 303-310. doi:10.1016/j.ctrv.2011.06.006, , 2012

35. Metformin in early breast cancer : a prospective window of opportunity neoadjuvant study, Niraula , S. , Dowling , R. J. O. , Ennis , M. , Chang , M. C. , Done , S. J. , Hood , N. , . . . Goodwin , P. J ., 135 ( 3 ) , 821-830. doi:10.1007/s10549-012- 2223-1, , 2012

36. Role of Pemetrexed and Platinums Combination in Patients with Non-Small Cell Lung Cancer ., Chen , M. Y. , Shao , W. L. , He , J. X. , & Wang , D. Y ., 11 ( 1 ) , 29-36. doi:10.2174/138945010790031027, , 2010

37. Osimertinib resistance in non-small cell lung cancer : Mechanisms and therapeutic strategies, Tang , Z. H. , & Lu , J. J ., 420 , 242-246. doi:10.1016/j.canlet.2018.02.004, , 2018

38. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling ., Engelman , J . A. , Zejnullahu , K. , Mitsudomi , T. , Song , Y. C. , Hyland , C. , Park , J. O. , . . . Janne , P. A ., 316 ( 5827 ) , 1039-1043. doi:10.1126/science.1141478, , 2007

39. Curcumin inhibits the mammalian target of rapamycin-mediated signaling pathways in cancer cells, Beevers , C. S. , Li , F. J. , Liu , L. , & Huang , S. L., 119 ( 4 ) , 757-764. doi:10.1002/ijc.21932, , 2006

40. Supporting Aspartate Biosynthesis Is an Essential Function of Respiration in Proliferating Cells, Sullivan , L. B. , Gui , D. Y. , Hosios , A. M. , Bush , L. N. , Freinkman , E. , & Vander Heiden , M. G., 162 ( 3 ) , 552-563. doi:10.1016/j.cell.2015.07.017, , 2015

41. GLUTAMATE OXIDATION IN 6C3HED LYMPHOMA - EFFECTS OF LASPARAGINASE ON SENSITIVE AND RESISTANT LINES, Lavietes , B . B. , Regan , D. H. , & Demopoulos , H. B ., 71 ( 10 ) , 3993-3997. doi:10.1073/pnas.71.10.3993, , 1974

42. Genotype Driven Therapy for Non-Small Cell Lung Cancer : Resistance , Pan Inhibitors and Immunotherapy, Singh , S. S. , Dahal , A. , Shrestha , L. , & Jois , S. D., 27 ( 32 ) , 5274-5316. doi:10.2174/0929867326666190222183219, , 2020

43. Targeting the KRAS variant for treatment of non-small cell lung cancer : potential therapeutic applications, Ricciuti , B. , Leonardi , G. C. , Metro , G. , Grignani , F. , Paglialunga , L. , Bellezza , G. , . . . Crino , L., 10 ( 1 ) , 53-68. doi:10.1586/17476348.2016.1115349, , 2016

44. Inhibition of glutaminase expression by antisense mRNA decreases growth and tumourigenicity of tumour cells ., Lobo , C. , Ruiz-Bellido , M. A. , Aledo , J. C. , Marquez , J. , de Castro , I. N. , & Alonso , F. J ., 348 , 257-261. doi:10.1042/0264-6021:3480257, , 2000

45. Isotope Tracing of Human Clear Cell Renal Cell Carcinomas Demonstrates Suppressed Glucose Oxidation In Vivo ., Courtney , K. D. , Bezwada , D. , Mashimo , T. , Pichumani , K. , Vemireddy , V. , Funk , A. M. , . . . Maher , E. A ., 28 ( 5 ) , 793-+ . doi:10.1016/j.cmet.2018.07.020, , 2018

46. LKB1 Inactivation Dictates Therapeutic Response of Non-Small Cell Lung Cancer to the Metabolism Drug Phenformin, Shackelford , D. B. , Abt , E. , Gerken , L. , Vasquez , D. S. , Seki , A. , Leblanc , M. , . . . Shaw , R. J ., 23 ( 2 ) , 143-158. doi:10.1016/j.ccr.2012.12.008, , 2013

47. Blood gases and energy metabolites in mouse blood before and after cerebral ischemia : the effects of anesthetics, Schwarzkopf , T. M. , Horn , T. , Lang , D. , & Klein , J ., 238 ( 1 ) , 84-89. doi:10.1258/ebm.2012.012261, , 2013

48. Phase 1 Study of CB-839 , a First-in-Class , Glutaminase Inhibitor in Patients with Multiple Myeloma and Lymphoma, Vogl , D. T. , Younes , A. , Stewart , K. , Orford , K. W. , Bennett , M. , Siegel , D. , & Berdeja , J. G., 126 ( 23 ) ., , 2015

49. Stable isotope-labeling studies in metabolomics : new insights into structure and dynamics of metabolic networks ., Chokkathukalam , A. , Kim , D. H. , Barrett , M. P. , Breitling , R. , & Creek , D. J ., 6 ( 4 ) , 511-524. doi:10.4155/bio.13.348, , 2014

50. Antiproliferative and metabolic effects of metformin in a preoperative window clinical trial for endometrial cancer, Schuler , K. M. , Rambally , B. S. , DiFurio , M. J. , Sampey , B. P. , Gehrig , P. A. , Makowski , L. , & Bae-Jump , V. L., 4 ( 2 ) , 161-173. doi:10.1002/cam4.353, , 2015

51. An Essential Role of the Mitochondrial Electron Transport Chain in Cell Proliferation Is to Enable Aspartate Synthesis ., Birsoy , K. , Wang , T. , Chen , W. W. , Freinkman , E. , Abu-Remaileh , M. , & Sabatini , D. M., 162 ( 3 ) , 540-551. doi:10.1016/j.cell.2015.07.016, , 2015

52. Phase I dose escalation study of temsirolimus in combination with metformin in patients with advanced/refractory cancers, Khawaja , M. R. , Nick , A. M. , Madhusudanannair , V. , Fu , S. Q. , Hong , D. , McQuinn , L. M. , . . . Naing , A ., 77 ( 5 ) , 973- 977. doi:10.1007/s00280-016-3009-7, , 2016

53. A Novel Allosteric Inhibitor of Phosphoglycerate Mutase 1 Suppresses Growth and Metastasis of Non-Small-Cell Lung Cancer ., Huang , K. , Liang , Q. , Zhou , Y. , Jiang , L. L. , Gu , W. M. , Luo , M. Y. , . . . Shen , Y ., 30 ( 6 ) , 1107-+ . doi:10.1016/j.cmet.2019.09.014, , 2019

54. Enhanced antitumor activity of erlotinib in combination with the Hsp90 inhibitor CH5164840 against non-small-cell lung cancer ., Ono , N. , Yamazaki , T. , Tsukaguchi , T. , Fujii , T. , Sakata , K. , Suda , A. , . . . Aoki , Y ., 104 ( 10 ) , 1346-1352. doi:10.1111/cas.12237, , 2013

55. ING5 knockdown enhances migration and invasion of lung cancer cells by inducing EMT via EGFR/PI3K/Akt and IL-6/STAT3 signaling pathways, Liu , X. L. , Zhang , X. T. , Meng , J. , Zhang , H. F. , Zhao , Y. , Li , C. , . . . Zhang , T., 8 ( 33 ) , 54265-54276. doi:10.18632/oncotarget.17346, , 2017

56. Amino Acid transporters in cancer and their relevance to glutamine addiction '' : novel targets for the design of a new class of anticancer drugs, Bhutia , Y. D. , Babu , E. , Ramachandran , S. , & Ganapathy , V., 75 ( 9 ) , 1782-1788. doi:10.1158/0008-5472.Can-14-3745, , 2015

57. Inhibition of oxidative phosphorylation suppresses the development of osimertinib resistance in a preclinical model of EGFRdriven lung adenocarcinoma, Martin , M. J. , Eberlein , C. , Taylor , M. , Ashton , S. , Robinson , D. , & Cross , D., 7 ( 52 ) , 86313-86325. doi:10.18632/oncotarget.13388, , 2016

58. Reversal of Warburg Effect and Reactivation of Oxidative Phosphorylation by Differential Inhibition of EGFR Signaling Pathways in Non-Small Cell Lung Cancer, De Rosa , V. , Iommelli , F. , Monti , M. , Fonti , R. , Votta , G. , Stoppelli , M. P. , & Del Vecchio , S., 21 ( 22 ) , 5110-5120. doi:10.1158/1078-0432.Ccr-15-0375, , 2015

59. Heterodimerization of insulin-like growth factor receptor/epidermal growth factor receptor and induction of survivin expression counteract the antitumor action of erlotinib ., Morgillo , F. , Woo , J. K. , Kim , E. S. , Hong , W. K. , & Lee , H. Y ., 66 ( 20 ) , 10100-10111. doi:10.1158/0008-5472.Can-06-1684, , 2006