Serratia marcesens Metalloprotease(SMP)와 그 억제단백질(SmaPI)의 분자생물학적 연구 = Molecular studies on Serratia marcescens metalloprotease (SMP) and its inhibitor protein (SmaPI). I. Analusis of secretory genes for SMP and utilization of the genes for vaccine production. II. Molecular studies on inhibitory mechanism of SmaPI toward SMP

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 S. marcescens metalloprotease(SMP)와 그 억제단백질(SmaPI)의 분자생물학적 연구를 수행하기 위해서 두 개의 세부과제로 되어 있다.
(제 1 세부과제) 본 연구는 SMP의 세포의 분비시스템을 규명하여 궁극적으로 SMP 분비시스템을 대장균에 도입하여 유용한 외래단백질을 대장균에서 세포의 배지 중으로 분비생산하는 기술을 개발하고자 한다. 이러한 목적을 달성하기 위해서 '95년부터 SMP의 secretion motif(분비신호)와 transporter(분비기구) 유전자를 찾는 연구를 수행하였다. 그 결과 SMP C-말단 41개 아미노산 부위가 분비신호로 작용함을 밝혔으며, SMP transporter 클로닝과정에서 분비조절 유전자 sec1 유전자를 클로닝하였다. 본 연구에서는 sec1 유전자의 기능과 SMP transporter 유전자를 클로닝하여 대장균에서 외래단백질을 분비시키는 분비시스템 구축하고자 목적하였다.
sec1 유전자의 기능을 연구한 결과 ① SMP 분비능이 상실된 M-10 변이주의 경우 sec1 유전자의 ORF1의 35번째 codon 다음에 T가 삽입되어 stop codon(TGA)이 만들어진 nonsense mutant였고, ② sec1 유전자가 변이된 경우 성장둔화, 삼투압 및 항생제에 대한 감수성이 증가되었고, ③ lipopolysaccharide에 있어서는 모균주와 sec1 변이주 사이에 뚜렷한 차이가 없었고, ④ sec1 유전자에는 2개의 ORF가 발견되었는데 이 중 하나만 없어도 SMP의 분비능이 상실되었다. 이러한 결과와 '96년의 결과 (sec1 변이주는 S. marcescens의 SMP, lipase, chitinases 등의 분비를 억제하였고 SMP의 전사수준에는 영향을 미치지 않음)를 종합해 볼 때 sec1 유전자는 S. marcescens의 단백질분비에 있어 global regulation에 관여하는 것으로 판단되는 중요한 유전자로 생각된다. sec1 연구와는 별도로 SMP transporter 유전자로서 S. marcescens lipase의 transporter (lipBCD+lipB+lipC+lipD)를 PCR 방법으로 클로닝하였다. lipBCD 유전자는 대장균에서 분비되지 않는 S. marcescens lipase와 SMP를 세포의 배지 중으로 원활히 분비하였다. 이러한 결과는 SMP의 transporter system이 대장균에서도 잘 작동된다는 것을 의미하였다. 지금까지의 연구를 통하여 확보된 SMP secretion motif와 SMP transporter를 활용하여 항원, 항암제(endostatin, angiostatin) 등을 대장균에서 세포의 배지 중으로 분비할 수 있을 것으로 기대된다.
(제 2 세부과제) 본 연구는 SMP의 연구 중에 발견된 그 억제단백질 SmaPI의 억제작용 기작을 분자생물학적으로 규명하고자 하며 궁극적으로 암전이 등에 있어 중요한 역할을 담당하는 metalloprotease의 일반적인 억제기작을 밝혀 내고자 한다. '96년의 연구결과 SmaPI의 N-말단의 순차적 절단과 아미노산치환을 통해서 N-말단부위가 억제작용에 중요한 역할을 한다는 것을 알았다. 본 연구에서는 Leu-5, Pro-6의 역할을 알아내고 다른 serralysin family 억제제들과의 비교연구를 수행하고자 계획하였다.
SmaPI의 저해활성에 있어서 Leu-5와 Pro-6의 역할을 규명하기 위해서 여러 가지 부위특이 돌연변이기법을 도입했다. L5A와L5G mutant SmaPI은 SMP에 대해서 상당한 저해활성을 나타내었다. 이 결과는 Leu-5의 side chain이 저해활성에 있어서 중요하다라고 사료된다. 놀랍게도 L5I와L5V mutant는 L5A mutant보다 덜 저해한다. 이 결과로부터 SmaPI의 5번잔기인 소수성 부분이 SmaPI의 저해활성에 중요하리라고 짐작되나 사슬잔기에서 aliphatic group의 위치와 방향이 또한 매우 중요하리라 생각된다. Pro-6잔기를 Ala 혹은 Gly으로 전환되어진 mutant의 저해활성도는 또한 극적으로 감소되었다. Pro-6이 SmaPI의 저해활성에 있어서 중요한 N-terminal peptde segment의 conformation을 유지하는데 있어서 결정적 역할을 하리라고 생각된다. 결론적으로 Leu-5와 Pro-6이 SMP에 대한 SmaPI의 저해활성에 종요한 역할을 하리라 사료된다. SmaPI와 다른 serralysin 억제제를 비교하기 위해, E. chrysanthemi B374, E. chrysanthemi EC16 inhibitor, 그리고 P. aeruginosa alkaline protease inhibitor를 Bacillus subtilis에서 발현, 정제하였다. SMP에 대한 이들의 억제능 측정결과 SmaPI가 가장 SMP를 강하게 억제하였다. 융합 재조합 단백질 실험 결과, SamPI의 N-말단 이외의 부위는 억제제의 specificity를 부여하는데 관여하는 것으로 사료된다. 이상의 연구를 통해서 metalloprotease와 그 억제제의 일반적인 억제, 결합 방식을 알아내는데 기초적인 정보를 제공하리라 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• 요 약
• Ⅰ. 제 1세부과제:SMP 분비유전자의 분석과 백신개발에의 활용
• 1.서 론
• 2.실험재료 및 방법
• 3.결과 및 논의
• 4.결 론
• 5.참 고 문 헌
• Ⅱ. 제 2세부과제:SmaPI의 SMP 억재기작 규명
• 1.서 론
• 2.재료 및 방법
• 3.결과 및 논의
• 4.결 론
• 5.참 고 문 헌
• Ⅲ. 발표논문 및 초록 첨부