Functionalized Single-walled Carbon Nanotubes for Topical Skin Delivery of Tyrosinase = 기능화한 단일벽 탄소나노튜브를 이용한 단백질 약물의 피부 국소 전달

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Tyrosinase is an essential enzyme that mediates melanin synthesis in melanocytes to protect skin from ultraviolet (UV) induced damage. If melanocytes stop producing functional tyrosinases, skin diseases such as albinism and vitiligo can occur. One promising way to treat these skin diseases is the delivery of tyrosinase directly to the skin to produce synthetic melanin. Since protein-based drugs are sensitive to environmental change, topical delivery is an appropriate method for tyrosinase delivery. However, the large size of tyrosinase (31.5 kDa) makes it hard to penetrate the skin barrier. Therefore, a functionalized single-walled carbon nanotube (SWNT) was introduced as a nanocarrier of tyrosinase and a reverse electrodialysis (RED) battery was also utilized to accelerate the transport of the tyrosinase–SWNT complex (TYR–SWNT) by electrostatic repulsion. The characteristic properties and dimensions of the TYR–SWNTs were analyzed to confirm that it is suitable for topical skin delivery while maintaining the tyrosinase activity. The penetration efficiency of TYR–SWNT was observed in ex vivo porcine skin and in vivo mouse skin using confocal Raman microscopy. It was demonstrated that with the assistance of SWNT and RED, tyrosinase could be effectively delivered to the skin, which was sufficient to synthesize melanin with endogenous L-tyrosine. This study presents a carbon nanocarrier-based topical protein delivery platform that can be utilized for various medical applications.

국문 초록 (Abstract)

티로시나아제는 피부 표피 기저막에 위치하고 있는 멜라닌세포에서 멜라닌 합성을 촉진하는 산화 효소이다. 티로시나아제가 피부 내에서 생성되지 못하거나 오작동하게 되면 백반증이나 알비노 등의 피부질환이 발생하며, 자외선으로 인한 손상으로부터 피부를 보호할 수 없게 된다. 티로시나아제를 직접 피부에 전달하는 것이 이러한 피부 질환을 치료하기 위한 하나의 방안이 될 수 있다. 티로시아나제를 피부에 전달하기 위한 방법으로 국소 부위 전달 방식이 주목받고 있는데, 국소 부위 전달 방법은 전달 과정에서 환경의 변화가 적기 때문에 단백질 약물의 분해나 변성을 방지할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 티로시아나제는 31.5 kDa의 큰 분자량을 가지고 있기 때문에 피부 장벽을 투과하기 어렵다. 따라서, 본 연구에서는 기능화된 단일벽 탄소 나노 튜브(Single-walled carbon nanotube, SWNT)를 나노전달체로써 사용하여 티로시나아제의 피부 투과 능력을 향상시키려 하였다. 또한 역전기 투석을 기반으로 한 배터리를 이용하여 정전기적 반발력을 유도해 티로시네나아제와 SWNT의 복합체(Tyrosinase immobilized SWNT, TYR–SWNT)의 전달 효율을 높이고자 하였다. 카복시메틸셀룰로스, 아자이드 기능기, 지질로 기능화된 세 가지 종류의 SWNT 후보군을 제작하여 피부 투과 능력을 공초점 라만 현미경을 통해 분석하였다. 소수성 성질을 갖는 지질로 기능화된 SWNT (Lipid–SWNT)가 피부를 투과하기 가장 적합함을 확인하였으며, Lipid–SWNT를 티로시나아제의 전달체로 선정하여 TYR–SWNT를 제작하였다. TYR–SWNT가 피부에 전달하기 적합한 전하 및 크기를 가지고 있음을 확인하였으나, SWNT에 고정화된 티로시나아제는 모노페놀 산화 효소 초기 활성에 지연 현상이 있는 것을 관찰했다. TYR–SWNT는 생체 외 돼지 피부와 생체 내 알비노 쥐 피부에 전달되었으며, 두 경우 모두 멜라닌을 합성할 수 있는 깊이인 200 μm 이상까지 투과된 반면, 다른 장기에는 전달되지 않는 것을 공초점 라만 현미경을 통해 확인하였다. 본 연구를 통해 개발된 단일벽 탄소나노뷰트 기반의 티로시나아제 피부 국소 전달 시스템은 향후 다양한 단백질 단백질 약물 전달에 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Literature survey 6
• 2.1. Tyrosinase 6
• 2.2. Skin protecting effect of tyrosinase 6
• 2.3. Topical skin delivery of protein drug 7
• 2.4. Single-walled carbon nanotube 8
• 2.5. Iontophoresis 10
• Ⅲ. Materials and methods 11
• 3.1. Materials 11
• 3.2. Preparation of functionalized SWNTs 11
• 3.2.1. Preparation of CMCSWNT 11
• 3.2.2. Preparation of N3SWNT 12
• 3.2.3. Preparation of LipidSWNT 12
• 3.3 Preparation of tyrosinase-conjugated SWNT (TYRSWNT) 13
• 3.4. Characterization of nanoparticle 13
• 3.5. Quantification of covalently conjugated tyrosinase on SWNT 14
• 3.6. Evaluation of the enzymatic activity of TYRSWNT 15
• 3.7. Evaluation of ex vivo penetration of nanocarrier 15
• 3.8. In vivo skin penetration and biodistribution of TYRSWNT 16
• Ⅳ. Results and discussion 17
• 4.1. Preparation of functionalized SWNT for enhancing skin penetration efficiency 17
• 4.2. Screening of SWNT with the most effective skin permeability 20
• 4.3. Fabrication of TYR-immobilized SWNT for topical skin delivery 23
• 4.4. Kinetic properties of immobilized Tyrosinase 33
• 4.5. Ex vivo topical skin delivery of TYRSWNT 39
• 4.6. Biodistribution of TYRSWNT 41
• Ⅴ. Conclusion 60
• Ⅵ. References 62
• 초록 69