Identification and expression analysis of response to high temperature and infection of NOD1/2 in the black rockfish （Sebastes schlegelii） = 조피볼락（Sebastes schlegelii） NOD1/2 동정 및 고수온·감염 발현 분석|RISS 상세보기

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Temperature is a critical environmental factor influencing physiological homeostasis and immune function in poikilothermic fish. Recent increases in seawater temperature associated with climate change have become a major threat to marine aquaculture by increasing disease susceptibility and mortality in cultured fish species, including black rockfish （Sebastes schlegelii）. Nucleotide-binding oligomerization domain-containing proteins, NOD1 and NOD2, are intracellular pattern recognition receptors that play essential roles in innate immune responses. However, their molecular characteristics and responses to high-temperature stress in black rockfish remain poorly understood. Therefore, this study aimed to characterize the NOD1 （SsNOD1） and NOD2 （SsNOD2） genes in S. schlegelii and investigate their expression profiles under high-temperature stress and bacterial infection.
Full-length cDNA sequences of SsNOD1 and SsNOD2 were successfully cloned and characterized. Both proteins exhibited the conserved tripartite domain architecture typical of NLR family members, consisting of CARD, NACHT, and LRR domains, together with conserved ATP-binding and hydrolysis motifs within the NACHT domain. A teleost-specific sequence variation was identified in the LRR region of NOD2, and phylogenetic analysis confirmed that SsNOD1 and SsNOD2 clustered with their respective vertebrate orthologs.
Basal expression analysis revealed that both genes were constitutively expressed in all examined tissues but displayed distinct tissue-specific expression patterns. SsNOD1 showed the highest expression in the spleen, whereas SsNOD2 was most highly expressed in the gill. Under bacterial challenge and combined high-temperature and bacterial challenge conditions, transcript levels of both genes were rapidly induced, reaching their highest levels at 24 h post-treatment （HPT） before gradually declining. In contrast, exposure to high temperature alone resulted in a delayed transcriptional response, characterized by relatively low expression at 48 HPT followed by increased expression at 96 HPT. Furthermore, bacterial infection induced significantly higher expression of both genes in the gill than combined treatment at 24 HPT, whereas no apparent difference between the two treatments was observed in the spleen, suggesting tissue-specific regulation of NOD-mediated immune responses under multiple stress conditions.
These findings indicate that SsNOD1 and SsNOD2 are involved not only in innate immune responses against bacterial infection but also in transcriptional responses to high-temperature stress. Moreover, elevated temperature appears to modulate NOD1- and NOD2-mediated immune responses in a tissue-dependent manner. This study provides fundamental insights into the molecular characteristics and regulatory mechanisms of NOD1 and NOD2 in black rockfish and contributes to a better understanding of immune regulation under concurrent environmental and pathogenic stress

번역하기

국문 초록 (Abstract)

온도는 변온동물인 어류의 생리적 항상성과 면역 기능을 결정하는 핵심 환경 요인으로, 최근 기후변화에 따른 해수온 상승은 양식 어류, 특히 조피볼락의 폐사의 원인으로 지목되고 있다. 본 연구는 조피볼락（Sebastes schlegelii）의 NOD1 （SsNOD1）과 NOD2 （SsNOD2） 유전자를 클로닝하여 전장 cDNA 서열을 확보하고, 분자적 특성 및 계통학적 위치를 분석하였다. SsNOD1과 SsNOD2 모두 클로닝에 성공하였으며, 두 단백질 모두 NLR 계열의 전형적인 삼중 도메인 구조（CARD-NACHT-LRR）를 보유하는 것을 확인하였다. NACHT 도메인 내 ATP 결합 및 가수분해 관련 보존 모티프（Walker A, Extended Walker B, Sensor 1, GxP, Sensor 2）의 핵심 잔기가 모두 보존되어 있음을 확인하였다. 흥미롭게도, 경골어류 NOD2의 LRR8 영역에서는 포유류 NOD2에 존재하는 28개의 아미노산이 공통적으로 결실되어 있었으며, 이는 경골어류 NOD2의 계통 특이적 서열 패턴으로 판단되었다. 계통수 분석 결과 두 단백질 모두 척추동물의 계통학적 분화를 전반적으로 반영하였으나, NOD2는 조류 및 파충류에서 확인되지 않아 NOD1과 상이한 계통학적 분포를 나타내었다.
조직별 기저 발현 분석 결과, SsNOD1과 SsNOD2는 조사한 5개 조직 모두에서 검출되었으나, 발현 수준은 조직에 따라 서로 다른 양상을 보였다. SsNOD1은 비장에서 가장 높은 발현을 보였고 간에서 가장 낮은 발현을 나타낸 반면, SsNOD2는 아가미에서 가장 높은 발현 수준을 보였다. 처리 조건별 발현 분석에서는 병원균 단독 처리군과 병원균-고수온 복합 처리군 모두에서 SsNOD1 및 SsNOD2 발현이 주로 24 HPT에 증가한 뒤 이후 시간대에서 감소하는 양상을 보였다. 반면 고수온 단독 처리군에서는 병원균이 포함된 처리군과 다른 발현 패턴이 관찰되었으며, 두 유전자의 발현은 대체로 48 HPT에 낮은 수준을 보인 뒤 96 HPT에서 다시 증가하는 경향을 나타냈다. 또한 아가미에서는 24 HPT에 병원균 단독 처리군의 SsNOD1 및 SsNOD2 발현량이 병원균-고수온 복합 처리군보다 높게 나타난 반면, 비장에서는 두 처리군 간 발현량 차이가 뚜렷하지 않았다. 이러한 결과는 고수온이 병원균 감염에 의해 유도되는 NOD1 및 NOD2 전사 반응에 영향을 미칠 수 있으며, 그 영향은 조직의 생리적 기능과 면역학적 특성에 따라 달라질 수 있음을 시사한다.
이러한 결과는 SsNOD1과 SsNOD2가 병원체 유래 PAMPs 인식을 통한 내재면역 활성화 기능뿐만 아니라 고수온이라는 비감염성 환경 스트레스에도 조직 특이적으로 반응함을 시사하며, 고수온 환경이 NOD1/2 매개 내재면역 반응을 유전자 및 조직 특이적으로 조절할 수 있음을 보여준다. 본 연구는 고수온-감염 복합 스트레스 환경에서 조피볼락 내재면역의 분자적 조절 기전을 이해하는 데 기초적인 근거를 제공하며, 기후변화 대응 양식 관리 전략 수립 및 해양생물의 면역 강화 방안 개발을 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

번역하기

온도는 변온동물인 어류의 생리적 항상성과 면역 기능을 결정하는 핵심 환경 요인으로, 최근 기후변화에 따른 해수온 상승은 양식 어류, 특히 조피볼락의 폐사의 원인으로 지목되고 있다. ...

목차 (Table of Contents)

I. Introduction 1
II. Materials and Methods 5
2.1. Experimental Fish 5
2.1.1. Rearing Conditions 5
2.1.2. Bacterial Challenge 6

I. Introduction 1
II. Materials and Methods 5
2.1. Experimental Fish 5
2.1.1. Rearing Conditions 5
2.1.2. Bacterial Challenge 6
2.1.3. High-Temperature Stress 6
2.1.4. Combined High-Temperature and Bacterial Challenge 6
2.1.5. Tissue Sampling 6
2.2. Preparation of Tissue Samples 7
2.2.1. Total RNA Extraction 7
2.2.2. cDNA Synthesis 8
2.3. Gene Cloning 8
2.3.1. mRNA Sequence Prediction and Primer Design 8
2.3.2. Cloning of NOD1 9
2.3.3. Cloning of NOD2 10
2.4. Bioinformatic Analyses 11
2.4.1. ORF and Protein Structure Analyses 11
2.4.2. Three-Dimensional Protein Structure Analysis 11
2.4.3. Multiple Sequence Alignment 12
2.4.4. Phylogenetic Analysis 12
2.5. Gene Expression Analysis 12
2.6. Statistical Analysis 14
III. Results 15
3.1. Cloning of SsNOD1 15
3.1.1. Analysis of the SsNOD1 mRNA Sequence 15
3.1.2. Analysis of the SsNOD1 Protein Sequence 15
3.1.3. Multiple Sequence Alignment of Teleost and Mammalian NOD1 Proteins 19
3.1.4. Phylogenetic Analysis 22
3.2. Cloning of SsNOD2 24
3.2.1. Analysis of the SsNOD2 mRNA Sequence 24
3.2.2. Analysis of the SsNOD2 Protein Sequence 24
3.2.3. Multiple Sequence Alignment of Teleost and Mammalian NOD2 Proteins 27
3.2.4. Comparative Three-Dimensional Protein Structure Analysis 30
3.2.5. Phylogenetic Analysis 32
3.3. Tissue Distribution of SsNOD1 and SsNOD2 Expression 34
3.3.1. Tissue Distribution of SsNOD1 Expression 34
3.3.2. Tissue Distribution of SsNOD2 Expression 34
3.4. Comparison of SsNOD1 and SsNOD2 Expression under Bacterial Challenge, High-Temperature Stress, and Combined Treatment 36
3.4.1. Comparison of SsNOD1 Expression Profiles 36
3.4.2. Comparison of SsNOD2 Expression Profiles 40
IV. Discussion 44
Abstract 53
References 63
감사의 글 73