Novel Candidates as Small-molecule Antibiotics Potentiated by Peptide Sensitizer against Gram-negative Bacteria: Advancing Development of Next Generation Sensitizer = Sensitizer 펩타이드에 의해 그람-음성 박테리아에 재배치되는 후보 저분자 항생제 : 차세대 펩타이드의 개발

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The outer membrane of Gram-negative bacteria acts as a formidable barrier against small molecule antibiotics seeking to penetrate into the bacterial interior. Developing antibiotics specifically targeting Gram-negative bacteria poses significant challenges due to the molecular physicochemical properties required for traversing their cell membrane, including a net positive charge, flat rather than globular structure, low flexibility, and high amphiphilic moment. Consequently, the development of antibiotics capable of permeating the cell membrane of Gram-negative bacteria necessitates specific physicochemical properties, making it a daunting task.
In light of this, the focus has shifted towards the development of sensitizing antimicrobial peptides that can adhere to the outer membrane, potentially enabling the passage of Gram-positive antibiotics. Extensive efforts have been devoted to enhancing their sensitizing capabilities through systematic adjustments in the length, hydrophobicity, and N-terminal modifications of alpha-helical peptides folded with proline. This exploration culminated in the successful creation of a novel peptide, 1403, exhibiting improved sensitization, effectively rendering Gram-positive antibiotics efficacious both extracellularly and intracellularly. The "sensitizer" approach is emerging as a more effective strategy, considering factors such as drug development costs and the possibility of drug resistance compared to conventional antibiotic development methods.
Furthermore, the combined treatment of sensitizing peptides with Gram-positive antibiotics has been demonstrated to not only treat Gram-negative bacteria effectively but also enhance their antimicrobial potency. Expanding the research scope, computational analyses utilizing physicochemical calculations were employed to identify molecules exhibiting robust antimicrobial activity when co-administered with peptides across different antibiotic classes, thereby distinguishing their varied physicochemical properties.
Of paramount importance is the ability of sensitizing peptides to overcome the restrictive physicochemical properties associated with known Gram-negative antibiotics, thereby dismantling existing paradigms and extending their action to a broader spectrum.
Subsequent development efforts have focused on the creation of next-generation sensitizing peptides based on the 1403 peptide. Mitochondria, with their unique lipid composition, particularly abundant cardiolipin in the inner mitochondrial membrane, served as a target for the development of peptides specifically targeting Gram-negative bacteria. By constructing an 8th generation peptide library, efforts were made to assess antimicrobial efficacy, with a strategic focus on maintaining high efficiency against the target while minimizing toxicity. Rational design strategies, including the incorporation of D-amino acid substitutions known for their resistance to protease degradation, were employed to enhance peptide stability. Additionally, efforts aimed at reducing alpha-helicity properties of the peptides, crucial for mitigating protease susceptibility, were pursued through proline-induced structural alterations. Notably, D-amino acid substitutions at positions 1, 2, and 15 of lysine were omitted to avoid compromising the helical conformation.
Ultimately, successful construction of a 9th generation peptide library was achieved. Peptides ranging from 1901 to 1904 were designed by replacing lysine residues at positions 5, 8, 9, and 12 of the original 1403 peptide sequence with D-lysine, while excluding positions 1, 2, and 15. Peptides from 1905 to 1909 were engineered to induce a kinked structure by utilizing proline from the original 1403 peptide sequence. Based on experimental findings, two peptides incorporating both strategies were synthesized: peptide 1910 fused the synthetic strategies applied to peptides 1904 and 1905, whereas peptide 1911 amalgamated those applied to peptides 1904 and 1909. Consequently, peptide 1911 exhibited significantly low toxicity and demonstrated superior sensitization efficacy at lower concentrations compared to other peptides. The development of peptide 1911, integrating both strategies, holds promise for achieving responsive antimicrobial effects at minimal toxicity levels within in vivo.

keywords : Sensitizer, Gram-negative bacteria, Antibiotics, Potentiator, physicochemical property, Cardiolipin, Cyclohexyl alanine, D-form substitution, Alpha helicity.
Student Number : 2021-27124

국문 초록 (Abstract)

그람-음성균의 외막은 박테리아 내부로 침투하기 위한 소분자 항생제에 대해 강력한 방해물로 작용합니다. 그람-음성균의 세포막을 통과하기 위한 그람-양성균용 항생제의 분자적 특성은 중성이 아닌 양전하, 구형 대신 평평한 구조, 낮은 유연성 및 높은 양친매성 모멘트가 요구됩니다. 따라서 그람-음성균의 세포막을 통과하기 위한 그람-양성균용 항생제의 개발은 특정한 물리화학적 특징이 요구되어 매우 어렵습니다. 이에 그람-양성균용 항생제의 통과가 가능할 수 있게 외막에 붙어 감응하는 감응 항균 펩타이드 개발에 중점을 두었습니다. 프롤린으로 접힌 구조를 이룬 α-헬릭스 펩타이드의 길이, 소수성 및 N-말단기에 대한 체계적인 조절을 통해 그들의 감응 능력을 향상시키기 위해 많은 변화와 노력을 하였습니다. 이 탐색의 결과로 리팜피신의 향상된 감응력을 나타내는 새로운 펩타이드 1403을 만드는 것에 성공하였습니다. 이 펩타이드는 생체 밖과 안에서 그람-양성균용 항생제를 효과적으로 감응시키는데, 기존의 항생제 개발 방법과 비교했을 때, "sensitizer" 접근법은 약물 개발 비용 및 약물 내성 발생 가능성과 같은 요소들을 고려할 때 더 유효한 전략으로 떠오르고 있습니다.
그람-양성균용 항균제를 감응 펩타이드와 공동으로 처리함으로써 그람-음성균을 치료하는 효과와 효율성 모두를 확인하였습니다. 더 나아가 감응 펩타이드와 공동으로 처리했을 때, 강력한 항균 능력을 나타내는 분자를 분석하기 위해 물리화학적 계산을 활용하여 연구 범위를 확장했습니다. 각 계열의 항생제에 따라 다양한 물리화학적 특징을 가지고 있고, 이를 3개 균에 펩타이드와 함께 효과를 확인해봄을써 이를 구분할 수 있었습니다.
중요한 것은 감응 펩타이드의 존재 하에 기존에 알려져있던 그람-음성균용 항균제의 제한적인 물리화학적 특징을 극복한다는 점입니다. 이는 감응 펩타이드를 통하여 알려져있는 틀을 붕괴시키고 더 넓은 범위에서 작용할 수 있다는 것을 시사합니다.
이후에는 후속 감응 펩타이드 개발을 위해 1403 펩타이드의 차세대 버전에 다양한 전략을 도입했습니다.
미토콘드리아는 특이한 지질 조성을 가진 세포 기관으로, 특히 내부 미토콘드리아 막에서 카디올리핀이 풍부한 독특한 지질 조성을 가지고 있습니다. 차세대 전략으로 미토콘드리아의 카디올리핀에 특이적으로 붙는다고 알려져 있는 아미노산은 사이클로헥실 알라닌이라는 아미노산인데, 이 아미노산을 이용하면 미토콘드리아 내로 침투할 수 있습니다. 그리고 카디올리핀은 박테리아 외막에도 많이 분포한다고 알려져 있습니다. 따라서 우리는 사이클로헥실 알라닌을 이용하여 그람-음성균에 더욱 특이적으로 반응할 수 있는 차세대 항균 펩타이드를 개발하고자 하였습니다.
이에 8세대 펩타이드 라이브러리를 구축하였고, 항균 능력을 확인하고자 했습니다. 타겟에 대한 높은 효율을 보여주었으나, 비교적 높은 소수성으로 인해 3개 이상의 아미노산 치환은 하지 않았습니다. 2개의 아미노산을 치환했을 때의 효과는 뛰어났으며, 감응 효과는 줄었으나, 펩타이드가 갖고 있는 항균 능력은 향상된 것을 확인할 수 있었습니다.
또 다른 개발 전략으로는 프로테아제 분해에 대한 펩타이드의 안정성을 향상시키기 위함이었습니다. 프로테아제 분해에 저항력이 있는 것으로 알려져 있는 D-형태의 아미노산 치환을 포함하여 펩타이드를 디자인하였습니다. 이러한 아미노산의 치환을 거친 후에는 기존 1403 펩타이드의 알파 나선성 성질을 감소시키는 것을 목표로 하였고, 알파 나선성을 줄이기 위해 프롤린을 이용하여 걲임 정도를 증가시키고자 하였습니다. 1, 2 및 15번째 위치의 리신에서의 D-형태의 아미노산 치환은 나선 모양을 줄이는 어려운 가능성을 고려하여 생략되었습니다.
결국 9세대 펩타이드 라이브러리를 구축하는 것에 성공하였습니다. 먼저, 1901에서 1904까지의 펩타이드는 기존 1403 펩타이드 서열의 5, 8, 9 및 12번째 위치의 리신을 D-형태의 리신으로 치환한 펩타이드이며, 그 중 1, 2 및 15번째 리신은 제외했습니다. 두 번째로 1905에서 1909까지의 펩타이드는 원래 1403 펩타이드 서열에서 프롤린을 이용하여 꺾인 구조를 가질 수 있게 유도되었습니다. 또한 실험 결과를 기반으로 두 전략을 모두 적용한 두 개의 펩타이드를 합성했습니다. 1910 펩타이드는 1904와 1905 펩타이드에 적용된 합성 전략을 융합하였고, 1911 펩타이드는 1904와 1909 펩타이드에 적용된 합성 전략을 융합했습니다. 결과적으로, 1911 펩타이드의 독성이 매우 낮았고, 낮은 농도에서 감응효과도 다른 펩타이드에 비해 매우 우수했습니다. 두 전략을 결합한 새로운 펩타이드 1911을 개발함으로써 생체 내에서 안정적이고 최소한의 독성을 가진 낮은 농도에서 항균제에 대한 감응 효과를 기대할 수 있습니다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract ⅰ
• Contents ⅴ
• List of figures ⅷ
• List of tables · ⅻ
• Chapter Ⅰ. Unlocking potential to Gram-positive
• antibiotics with peptide sensitization for
• broad-spectrum antimicrobial activity against
• Gram-negative bacteria
• 1. Abstract 1
• 2. Introduction 3
• 3. Experimental Section 7
• 3.1. Synthesis of peptides · 7
• 3.2. Minimum inhibitory concentration(MIC) assay · 8
• 3.3. Minimum hemolytic concentraion(MHC) assay 9
• 3.4. Flow cytometry assay 10
• 3.5. Cell viability assay · 11
• 3.6. Neutropenic murine thigh infection model 11
• 3.7. Protein synthesis inhibition assay 13
• 3.8. Neutropenic murine pneumonia model 14
• 3.9. Peptide structure prediction and modeling 15
• 3.10. Calculation of the physicochemical properties of the
• antibiotics · 15
• 3.11. Definitions of physicochemical properties · 16
• 4. Results and Discussion · 19
• 4.1. A novel 1403 peptide generated by length
• modification, Ala­scanning, and N­terminal fatty
• acid capping 19
• 4.2. Identifying physicochemical properties of new novel
• peptide 1403 22
• 4.3. Analysis of the in vitro efficiency of the novel
• sensitizer peptide · 24
• 4.4. Analysis of the in vivo efficiency of 1403 · 29
• 4.5. Discovering 31 antibiotics potentiated by 1403 and
• identifying their physicochemical properties ·· 31
• 4.6. Identifying the molecular physicochemical properites
• of antibiotics potentiated by 1403, with a specific
• focus on those categorized as protein synthesis
• inhibitors · 43
• 5. Conclusions 58
• 6. References · 59
• Chapter Ⅱ. Applying various strategies based on
• 1403 peptide
• 1. Abstract 64
• 2. Introduction 67
• 3. Experimental Section 69
• 3.1. Synthesis of peptides · 69
• 3.2. Minimum inhibitory concentration(MIC) assay · 70
• 3.3. Minimum hemolytic concentraion(MHC) assay 71
• 3.4. Cell viability assay · 72
• 3.5. Neutropenic murine pneumonia model 73
• 3.6. Peptide structure prediction and modeling · 74
• 4. Results and Discussion · 75
• 4.1. Development of 8th generation peptide library
• targeting bacterial cardiolipin 75
• 4.2. Analysis of the in vitro efficiency of 8th generation
• peptides 76
• 4.3. Analysis of the in vivo efficiency of 1812 peptide
• · 83
• 4.4. Development of 9th generation peptide library aimed
• at reducing alpha-helical property of 1403 peptide 87
• 4.5. Analysis of the in vitro efficiency of 9th generation
• peptides 90
• 4.6. In vitro efficiency of peptides integrating the two
• strategies 97
• 5. Conclusions 112
• 6. References · 114